一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法与应用，属于再生医学领域。本发明专利技术可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法包括以下步骤：(1)取动物小肠组织，依次进行漂洗、消毒和反复冻融处理；(2)将动物小肠组织剪断，刮除小肠的黏膜层、肌肉层和浆膜层，得到剥离的小肠黏膜下层，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中；(3)将小肠黏膜下层进行脱细胞处理，然后进行漂洗；(4)将小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡后，再置于除垢剂中震荡萃取，漂洗；(5)将小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡，冷冻干燥、研磨，即为可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。本发明专利技术得到的基质微粒富含生物活性成分且结构疏松多孔。

An injectable acellular intestinal submucosa matrix particle and its preparation and Application

The invention relates to an injectable acellular small intestinal submucosa matrix particle and a preparation method and application thereof, belonging to the field of regenerative medicine. The preparation method of the inject subcellular microparticles of the submucous submucosa of the cell includes the following steps: (1) taking the small intestinal tissue in order to rinse, disinfect, and repeatedly freeze and thaw, and (2) cut the small intestinal tissue, scrape the mucous layer, the muscle layer and the serous layer of the small intestine, and get the submucosa of the small intestine, which will be stripped. The submucosa of the small intestine was soaked in Sodium Chloride Solution; (3) the submucosa of the small intestine was deactivated and washed. (4) the submucosa of the small intestine was soaked in the buffer solution and then removed in the detergent and rinsed. (5) the submucosa of the small intestine was soaked in the buffer solution and frozen and dried. Lapping is an injectable acellular intestinal submucosal matrix. The matrix particles obtained by the invention are rich in bioactive components and are porous in structure.

【技术实现步骤摘要】
一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法与应用，属于再生医学领域。
技术介绍
注射微整形技术，是微整形的一种形式，以其微创、无痛和恢复期短等优势受到人们的追捧，是近几年流行起来的整形项目。在颌面部软组织缺陷的修复治疗、隆鼻和隆下巴中也逐渐显示出其创伤小、恢复快的独特优势。无论是单独使用还是作为正颌、正畸修复手术的补充，微创注射技术在创伤重建，颌面部软组织缺陷修复，隆鼻和隆下巴中具有广阔的应用前景。目前可以注射的材料主要有胶原蛋白，胶原蛋白可使表皮细胞变得丰满，从而使肌肤滋润、光滑、水嫩，具有弹性，随着年龄的增长，肌肤内的胶原白也随之减少，面部注射胶原蛋白就显得尤为重要。胶原蛋白中独有的羟脯氨酸具有收紧结缔组织的作用，能使松弛的组织紧实。但胶原蛋白由于体内胶原蛋白酶的存在，即便通过交联后的蛋白质，其维持时间也不超过六个月，需要定期注射以达到良好的治疗效果。还有一种注射材料是透明质酸，通过将其注射到面部真皮而达到修复较深层皱纹，还可以用来丰唇、隆下巴和隆鼻，使皮肤恢复弹性和光泽。注射后维持时间为六个月。而注射肉毒素，可以抑制周围运动神经末梢突触前膜乙酰胆碱释放，阻断神经和肌肉之间的信息传导，从而引起肌肉的松弛性麻痹。肉毒素可以除去皱纹，但是维持时间为6-8个月。中国专利CN200510044005.5公开了一种可注射软组织生物填充材料的制备方法，该方法采用猪皮经脱脂，脱细胞，戊二醛交联等工序，物理加工制成微粒。该专利制备微粒的方法只是将交联后材料通过物理方法切割成边长为300-500μm的微粒，然而其微粒粒径过大，无法采用直径较小的针头注射，从而限制其在注射整形领域的实用价值。中国专利CN02156797.2公开了一种注射性胶原蛋白的制备方法及其产品和应用，该方法采用动物组织中的胶原蛋白纤维类制备注射性胶原蛋白，然而在制备过程中会破坏动物组织原有结构及其他成分，也损失了组织中具有生物活性或生物功能的活性成分，只能单纯起到胶原蛋白的填充作用。如上所述，目前已上市的一些微创注射整形植入材料及国内同类专利公开的微创注射整形植入材料制备方法均存在一定的缺点，尤其是胶原和透明质酸植入剂产品，并未包含生物活性因子，因此其作用仅仅是填充，当这些填充材料被机体降解吸收后，组织修复效果就会消失，使其效果不佳。目前尚无采用脱细胞小肠黏膜下层为原料制备可注射的填充材料的产品，亦无专利及文献报道。现有技术产品在注射后未被降解的时间内，会起到一定的填充，抗皱作用，但是这材料随着植入时间的延长，会被机体的相关酶类逐渐降解吸收，由于其不存在活性成分，因此效果也会消失。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种富含生物活性成分、结构疏松多孔的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒及其制备方法与应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法，其包括以下步骤：(1)取动物小肠组织，依次进行漂洗、消毒和反复冻融处理；(2)将动物小肠组织剪断，刮除小肠的黏膜层、肌肉层和浆膜层，得到剥离的小肠黏膜下层，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中；(3)将小肠黏膜下层进行脱细胞处理，然后进行漂洗；(4)将经步骤(3)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡后，再置于除垢剂中震荡萃取20-30小时，漂洗；(5)将经步骤(4)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡，然后冷冻干燥、研磨，得到可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。作为本专利技术所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)采用消毒剂进行消毒，所述消毒剂由(Ⅰ)体积分数为5-30％的乙醇水溶液，和(∏)体积分数为0.2-2％的过氧乙酸水溶液和/或体积分数为0.5-10％的过氧化氢水溶液组成；所述步骤(1)中，反复冻融的方法为：将动物小肠组织置于-80℃冰箱中冷冻0.5-3小时，然后取出，于37℃下解冻0.1-1小时；反复冻融的次数为2-5次。作为本专利技术所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述动物小肠组织为哺乳动物小肠组织；优选的，所述动物小肠组织取自屠宰两小时内哺乳动物的小肠组织。作为本专利技术所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中3-6小时，氯化钠溶液中氯化钠的浓度为0.5-3mmol/L。作为本专利技术所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，脱细胞处理的方法为：将小肠黏膜下层先置于脱细胞液A中浸泡8-24小时，漂洗，再置于脱细胞液B中浸泡8-24小时；其中，所述脱细胞液A含有下述质量百分比的组分：(a)0.01-1％EDTA三钠或四钠，和(b)2-10％碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠或磷酸钾；所述脱细胞液B含有下述浓度的组分：(c)0.8-2mol/LHCl、磷酸、硫酸、醋酸、乳酸或甘醇酸，和(d)0.8-4mol/L氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸钾；所述脱细胞液A和脱细胞液B与小肠黏膜下层的体积比均为4-30：1。作为本专利技术所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，除垢剂为曲拉通溶液，所述曲拉通溶液中曲拉通的质量百分比为1-4％。作为本专利技术所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(5)为：将经步骤(4)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡10-16小时，然后冷冻干燥、研磨，再筛选粒径为20-200μm的微粒，即为可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。由于所得脱细胞小肠黏膜下层基质微粒直径为20-200μm，可使用25-27g小针头注射。作为本专利技术所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)中，采用缓冲溶液进行漂洗。作为本专利技术所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)和步骤(5)中，缓冲溶液为PBS溶液。另外，本专利技术还提供了一种采用上述方法得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。本专利技术以动物小肠组织为原料制备可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒，较以软组织和脂肪组织为原料而言，本专利技术制得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒无免疫介导的炎性反应，且富含生长因子。另外，本专利技术制得的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒结构疏松多孔，在保持支架结构的基础上，多孔的结构有利于细胞组织长入，和脂肪组织、软组织为原料相比，有更好的结构特点，且含有更多的Ⅳ型胶原，因为Ⅳ型胶原主要是存在于基底膜这个组织中。本专利技术可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒(SIS)含有生物及细胞活性的细胞外基质成分，主要含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原，血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)等多种生长因子，还含有天然粘多糖(透明质酸、硫酸软骨素)、糖蛋白类(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)以及SOD(SuperoxideDismutase，超氧化物歧化酶)。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原等通过改善表皮细胞生长微环境，促进微循环，增强新陈本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取动物小肠组织，依次进行漂洗、消毒和反复冻融处理；(2)将动物小肠组织剪断，刮除小肠的黏膜层、肌肉层和浆膜层，得到剥离的小肠黏膜下层，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中；(3)将小肠黏膜下层进行脱细胞处理，然后进行漂洗；(4)将经步骤(3)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡后，再置于除垢剂中震荡萃取20‑30小时，漂洗；(5)将经步骤(4)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡，然后冷冻干燥、研磨，得到可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。

【技术特征摘要】
1.一种可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取动物小肠组织，依次进行漂洗、消毒和反复冻融处理；(2)将动物小肠组织剪断，刮除小肠的黏膜层、肌肉层和浆膜层，得到剥离的小肠黏膜下层，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中；(3)将小肠黏膜下层进行脱细胞处理，然后进行漂洗；(4)将经步骤(3)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡后，再置于除垢剂中震荡萃取20-30小时，漂洗；(5)将经步骤(4)处理的小肠黏膜下层置于缓冲溶液中浸泡，然后冷冻干燥、研磨，得到可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒。2.如权利要求1所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)采用消毒剂进行消毒，所述消毒剂由(Ⅰ)体积分数为5-30％的乙醇水溶液，和(∏)体积分数为0.2-2％的过氧乙酸水溶液和/或体积分数为0.5-10％的过氧化氢水溶液组成；所述步骤(1)中，反复冻融的方法为：将动物小肠组织置于-80℃冰箱中冷冻0.5-3小时，然后取出，于37℃下解冻0.1-1小时；反复冻融的次数为2-5次。3.如权利要求1所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将剥离的小肠黏膜下层浸泡于氯化钠溶液中3-6小时，氯化钠溶液中氯化钠的浓度为0.5-3mmol/L。4.如权利要求1所述的可注射的脱细胞小肠黏膜下层基质微粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，脱细胞处理的方法为：将小肠黏膜下层先置于脱细胞液A中浸泡8-24小时，漂洗，再置于脱细胞液B中浸泡8-24小时；其中，所述脱细胞液A含有下述质量百分比的组分：(a)0.01-1％EDTA三钠或四钠，和(b)2-10％碳酸钠、碳酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨伟红，程飚，王祥林，耿梦梦，晏兰，苏玉天，刘江辉，
申请(专利权)人：广州昕生医学材料有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44