培养和/或使造血干细胞分化为祖细胞的方法及其用途技术

本说明书涉及用于在轻度高温条件(例如，在38℃与40℃之间)下，在造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂存在下培养造血干细胞(HSC)的体外方法。组合使用轻度高温和嘧啶并吲哚衍生物协同地起作用，以促进CD34+HSC扩增和/或分化为祖细胞(例如，巨核细胞祖细胞)。本说明书还涉及体外扩增的HSC和/或祖细胞的细胞群体，以及它们在治疗(例如，移植)中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】培养和/或使造血干细胞分化为祖细胞的方法及其用途本说明书涉及造血干细胞。更具体地，本说明书涉及在轻度高温(例如，在38℃与40℃之间)和在造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂存在下培养造血干细胞。专利技术背景造血干细胞(HSC)来源于中胚层，并负责产生见于血液中的所有细胞组分，无论是髓系还是淋巴系。HSC分化为共同髓样祖细胞(CMP)和共同淋巴样祖细胞(CLP)。CMP产生红系、粒细胞系、单核细胞系、巨核细胞系和树突系细胞，而CLP衍生T和B淋巴细胞、浆细胞、自然杀伤细胞和淋巴样树突细胞。髓系细胞的终末分化最终导致产生和更新红细胞、粒细胞、单核细胞、髓源树突细胞和血小板。此外，HSC(原始或长期)具有自我更新能力，因此确保为个体整个生命期充足地供应祖细胞和终末分化的血细胞。这些细胞自我更新的能力导致了医学领域的重大进展，即HSC移植作为患有血液学癌症或骨髓衰竭的患者的治疗模式。历史上，骨髓是HSC的主要来源，且至今仍是骨髓更换的重要细胞来源。从那以后，来自G-CSF动员捐赠者的脐带血和外周血也用作HSC来源。与其在临床中的使用并行，HSC已经成为目的在于在实验室中体外培养、扩增、分化为各种谱系的细胞和产生血液组分的紧张研究工作的主题。这种研究发现了几种谱系特异性细胞因子，现在常用于各种培养方法中，允许优先地使造血干细胞朝特定谱系生长和/或分化。此外，已发现，在发热样轻度高温(39℃而非37℃标准温度)下，在巨核细胞诱导细胞因子混合物存在下培养HSC导致朝巨核细胞系加速扩增和分化(Proulx等人，2004)。最近，因为能够扩增长期造血干细胞的能力而鉴别了一类嘧啶并吲哚化合物(Fares等人，2014)。尽管有了这些进展，体外扩增HSC和优先地朝特定髓系分化还有许多缺点。例如，还是很难体外扩增HSC，同时维持原始表型和受控分化。细胞有效地扩增和维持得到特定谱系也还是一个挑战。例如，以现今的技术水平，实现体外产生血液组分所需的扩增水平仍是不足的。此外，当前的培养方法通常产生异质细胞群体，不适合特定临床适应症的医学应用。特定干细胞和祖细胞群体的体外产生将需要实质性改进方能在临床中使用它们。因此，需要能够大规模体外扩增，同时允许控制造血干细胞和祖细胞分化为用于临床使用的均质细胞群体的方向和程度以及大规模产生的方法和技术。本说明书引用了许多文献，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。专利技术概述本说明书缘起于出乎意料地发现可以在轻度高温(例如，在38℃与40℃之间)和在造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂存在下有利地培养造血干细胞(HSC)。组合使用轻度高温和嘧啶并吲哚衍生物在本文示出协同地起作用，以促进CD34+HSC(包括长期HSC)扩增和/或分化为“谱系待发(lineage-primed)”或祖细胞，和/或维持(例如，髓样祖细胞、巨核细胞祖细胞)。实际上，在一些实施方案中，当使用有利于造血干细胞自我更新的培养基时，示出轻度高温和造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂的组合使HSC(CD34+细胞)呈指数级扩增。不受理论的约束，本文公开的结果表明，轻度高温结合使用嘧啶并吲哚化合物保留嘧啶并吲哚化合物的抗分化效果，同时加强轻度高温孵育温度的刺激效果。在其他实施方案中，当使用有利于朝巨核细胞系分化的培养条件时，还示出了轻度高温与造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂的组合指数级地增加HSC分化为祖细胞(例如，髓样祖细胞、巨核细胞祖细胞)。不受理论的约束，本文公开的结果表明，嘧啶并吲哚化合物在成熟巨核细胞阶段之前阻断HSC的高温诱导的分化，和/或优先扩增和维持巨核细胞祖细胞。因此，在一些实施方案中，可以移除嘧啶并吲哚化合物，且细胞可以在轻度高温条件下进一步繁殖，从而产生更同步的细胞群体。因此，本说明书可以涉及以下方面：1.一种用于培养造血干细胞的体外方法，所述方法包括：(a)在含造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂的细胞培养基中繁殖所述造血干细胞；和(b)在38℃与40℃之间的孵育温度下孵育所述造血干细胞。2.方面1的方法，其中所述造血干细胞是CD34+造血干细胞。3.方面1或2的方法，其中所述造血干细胞来自：(a)脐带血；(b)骨髓；(c)外周血；(d)诱导多能干细胞；(e)胚胎干细胞；(f)从非造血起源的分化细胞转分化；(g)经基因修饰的造血干细胞；(h)永生化造血干细胞；(i)其他多能或多潜能细胞来源；或(j)其任何组合。4.方面3的方法，其中所述造血干细胞来自动员外周血细胞。5.方面3的方法，其中所述造血干细胞来自非动员外周血细胞。6.方面4或5的方法，其中所述造血干细胞来自去白细胞(leukoreduction)、减白细胞(deleukocytation)和/或其他外周血血液纯化或加工后的残余细胞。7.方面1至6中任一项的方法，其中在含造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂的细胞培养基中，和/或在38℃与40℃之间的孵育温度下，孵育所述造血干细胞至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。8.方面1至7中任一项的方法，其中所述孵育温度是39℃。9.方面1至8中任一项的方法，其中所述造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂是：(a)嘧啶并[4,5-b]吲哚衍生物；(b)(1r,4r)-N1-(2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)环己烷-1,4-二胺；(c)4-(3-(哌啶-1-基)丙基氨基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯；(d)4-(3-(哌啶-1-基)丙基氨基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯盐酸盐；(e)(a)至(d)中任一个的药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体；或(f)(a)至(e)的任何组合。10.方面1至9中任一项的方法，其中所述细胞培养基包含干细胞因子(SCF)；促血小板生成素(TPO)；或SCF和TPO两者。11.方面1至9中任一项的方法，其中所述方法是用于扩增造血干细胞，且其中所述细胞培养基是造血干细胞培养基。12.方面11的方法，其中所述造血干细胞培养基包含：人类FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3)；干细胞因子(SCF)；促血小板生成素(TPO)；低密度脂蛋白(LDL)；或其任何组合。13.方面1至9中任一项的方法，其中所述方法是用于培养造血干细胞以产生巨核细胞祖细胞，且其中所述细胞培养基是促进造血干细胞朝巨核细胞系分化的培养基。14.方面13的方法，其中所述促进造血干细胞朝巨核细胞系分化的培养基包含：干细胞因子(SCF)；促血小板生成素(TPO)；人类FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3)；IL-6；IL-9；或其任何组合。15.方面1至9中任一项的方法，其中所述方法是用于培养造血干细胞以产生髓样祖细胞，且其中所述细胞培养基是促进造血干细胞朝髓样祖细胞系分化的培养基。16.方面1至15中任一项的方法，其进一步包括：(c)移除所述造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂，并继续在38℃与40℃之间的孵育温度下或在约37℃的孵育温度下繁殖所述细胞，从而使所述细胞同步。17.一种体外扩增的细胞群体，其是：(a)通过方面11或12的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于培养造血干细胞的体外方法，所述方法包括：(a)在含造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂的细胞培养基中繁殖所述造血干细胞；和(b)在38℃与40℃之间的孵育温度下孵育所述造血干细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.05 US 62/171,492;2016.05.13 US 62/335,9831.一种用于培养造血干细胞的体外方法，所述方法包括：(a)在含造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂的细胞培养基中繁殖所述造血干细胞；和(b)在38℃与40℃之间的孵育温度下孵育所述造血干细胞。2.权利要求1的方法，其中所述造血干细胞是CD34+造血干细胞。3.权利要求1或2的方法，其中所述造血干细胞来自：(a)脐带血；(b)骨髓；(c)外周血；(d)诱导多能干细胞；(e)胚胎干细胞；(f)从非造血起源的分化细胞转分化；(g)经基因修饰的造血干细胞；(h)永生化造血干细胞；(i)其他多能或多潜能细胞来源；或(j)其任何组合。4.权利要求3的方法，其中所述造血干细胞来自动员外周血细胞。5.权利要求3的方法，其中所述造血干细胞来自非动员外周血细胞。6.权利要求4或5的方法，其中所述造血干细胞来自去白细胞、减白细胞和/或其他外周血血液纯化或加工后的残余细胞。7.权利要求1至6中任一项的方法，其中在含造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂的细胞培养基中，和/或在38℃与40℃之间的孵育温度下，孵育所述造血干细胞至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述孵育温度是39℃。9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述造血干细胞扩增的嘧啶并吲哚衍生物激动剂是：(a)嘧啶并[4,5-b]吲哚衍生物；(b)(1r,4r)-N1-(2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)环己烷-1,4-二胺；(c)4-(3-(哌啶-1-基)丙基氨基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯；(d)4-(3-(哌啶-1-基)丙基氨基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯盐酸盐；(e)(a)至(d)中任一个的药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体；或(f)(a)至(e)的任何组合。10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述细胞培养基包含干细胞因子(SCF)；促血小板生成素(TPO)；或SCF和TPO两者。11.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述方法是用于扩增造血干细胞，且其中所述细胞培养基是造血干...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·拉格尼尔勒，N·杜蒙特，
申请(专利权)人：赫马魁北克公司，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA