一种基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片及其应用，包括具有多层图案的数字微流控芯片和集成电路两部分。所述的具有多层图案的数字微流控芯片由上、下极板两部分组成。上极板使用疏水化的导电玻璃作为地电极，集成电路作为数字微流控电路控制系统。本芯片可全自动捕获单颗粒/单细胞，操纵简单快速，且捕获效率高。样品能够实现无损回收，尤其适用于稀有样本。可通过程序控制实现捕获单元的连续复杂平行操纵，且无交叉污染，如对单颗粒的隔离、偶联、检测；对单细胞的隔离、培养、核酸扩增等，可广泛应用于单颗粒检测和单细胞分析等领域。

A fully automatic single particle / single cell capture chip based on digital microfluidic technology and its application

The invention discloses a fully automatic single particle / single cell capture chip and its application based on digital microfluidics technology, and includes two parts: a multi-layer digital microfluidic chip and an integrated circuit. The digital microfluidic chip with a multi-layer pattern is composed of two parts of the upper and lower plates. The upper plate uses the hydrophobic conductive glass as the ground electrode, and the integrated circuit is used as the digital microfluidic control system. This chip can automatically capture single particle / single cell. It is simple and fast, and the capture efficiency is high. The sample can be used for non - destructive recovery, especially for rare samples. Program control can realize continuous complex parallel operation of capture unit, and there is no cross contamination, such as isolation, coupling and detection of single particles. Isolation, culture and nucleic acid amplification of single cells can be widely used in single particle detection and single cell analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片及其应用
本专利技术属于数字微流控
，具体为一种基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片及其应用。
技术介绍
细胞作为生命体结构和功能的基本单元，是生命活动规律研究中的重要基础。现阶段的生命科学研究主要以大量的细胞为研究对象，采取对细胞群体的分析手段来获得细胞中的化学信息。然而，不同的细胞个体间存在着显著的微观不均一性(异质性)，基于大量细胞的实验结果统计分析结果会掩盖单细胞间的差异，难以反映单细胞水平上的生命活动规律，造成了医学、生物学及其它学科在深一步研究中受到限制。因此，基于单个细胞的研究，能够掌握更准确更全面的细胞信息，可以深入探讨以往群体分析中平均结果对个别信息掩盖的局限性，将能在更深的层次上揭示生命活动的本质和规律，单细胞分析的引入对与疾病的早期预防和诊断有重要的意义。尽管单细胞分析技术在很多应用领域中是至关重要的，然而单细胞体积小、所测组分含量低、偏差放大的特点使得单细胞的分离和分析面临着巨大的挑战。而且在细胞数目较多时，需要大量的重复操作，极其耗时，导致实验通量无法提升。微流控芯片利用结构各异的微通道和形式多样的外加力场，对微量流体或样品在微观尺度上进行操纵、处理与控制，从而实现了传统实验室的部分乃至全部功能在一块微芯片上的集成。相比于传统方法，其具有成本低、分析速度快、试剂消耗少等优势，代表着未来生物、化学分析走向微型化的发展方向。因此，微流控芯片作为单细胞分离和分析的最主要研究手段之一，被广泛应用于神经科学、干细胞生物学、发育生物学、癌症诊断和个性化药物筛选等领域中。然而，常规微流控芯片的局限性也是非常明显的，其需要机械泵、阀配合使用，集成化难度大，难以实现样品的连续多步处理；对多试剂位置和反应时间的精确控制捉襟见肘；并且无法实现对少量稀有细胞的单细胞俘获，在大量单细胞进行高效率高通量分析领域更是无能为力。数字微流控技术(Digitalmicrofluidics,DMF)作为一种新兴的离散化微液滴操纵手段，由于具有一系列传统微流控技术无法比拟的优点有望改变这一现状。数字微流控是一种基于微电极阵列来实现离散液滴精确控制(包括移动、合并、分配和分裂等操作)的新型液滴操纵技术，其利用液滴在疏水化表面上的介电润湿现象实现了大通量离散化液滴的可控精准操纵。相比于传统的实验处理技术，既拥有传统微流控技术样品消耗量少、高并行性的能力，同时，又不依赖微泵、微阀或微混合器等元件，不需要加工复杂的三维流体通道，具有可动态配置的优点。更为重要的是，数字微流控芯片可以实现由宏观大体积试剂到精确可控体积微纳液滴的生成，对精确控制反应条件、保证结果的精确有效性非常有利；而且，其微电极阵列驱动的方式具有高并行性和全自动化的特点，能够实现多通路实时可控反应，对于实现样品制备、反应、分离、检测等生化实验基本操作的完全集成化具有重要的意义，因此特别适用于单细胞分析研究。为了解决以上问题，我们提出了一种基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片。该芯片可以全自动地捕获单颗粒，而且单颗粒的捕获效率高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片，可以全自动高效率地捕获单颗粒/单细胞。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：该数字微流控芯片包括具有多层图案的数字微流控芯片和集成电路两部分。所述的具有多层图案的数字微流控芯片由上、下极板两部分组成，下极板包括基底、电极层、介质层、捕获层和局部亲水化的疏水层，上极板包括疏水化的地电极；集成电路为数字微流控电路控制系统。所述数字微流控芯片的下极板包括基底、电极层、介质层、捕获层和局部亲水化的疏水层，电极层可由湿法刻蚀技术、电路板印刷技术和打印技术等方法制作于基底表面，介质层均匀涂覆于电极层上表面，捕获层通过光刻等技术结合于介质层上方并与电极层特定位置对准，局部亲水化的疏水层在捕获层上表面，通过局部剥离等技术在捕获层周围形成特定的亲水图案，在其余区域形成疏水图案；所述上极板从下至上依次包括疏水层、接地导电层和上极板基底；电极层为具有特定图案的电极阵列，包括贮液池电极单元、液滴生成通道电极阵列、单颗粒/单细胞捕获电极阵列和反应电极区，液滴生成通道电极阵列分别与贮液池电极单元一一相连，并以单颗粒/单细胞捕获电极阵列和反应电极区为中心对称分列于其两侧；捕获层为具有单细胞捕获能力的微结构阵列，由具有小于单颗粒/单细胞尺寸间隙的微结构和流体分布微柱组成，该阵列与电极层特定位置对准；局部亲水化的疏水层是由局部剥离技术形成的具有局部亲水化位点的疏水层，其经对准可在捕获层的微结构处形成亲水化位点。本专利技术的一个优选的实施方式中，捕获层结构的尺寸有具体使用和分析的颗粒和细胞的大小决定。一般的，捕获层微结构间隙的宽度可以是5-500微米，例如：8微米、20微米、50微米、80微米、100微米、200微米、300微米或者400微米；高度可以是5-500微米，例如10微米、20微米、50微米、80微米、100微米、200微米、300微米或者400微米；流体分布微柱随微结构的大小形状变化而变化。本专利技术的一个优选的实施方式中，所述的颗粒的直径可以是5-200微米，例如5微米、10微米、15微米、20微米、30微米、70微米、80微米或者90微米。本专利技术的一个优选的实施方式中，所述的细胞的直径可以是5-100微米，例如5微米、10微米、15微米、20微米、30微米、70微米、80微米或者90微米。本专利技术的数字微流控芯片所述的亲水化位点的形状包括圆形、方形、半月形等，随捕获层形状的变化而变化。本专利技术的数字微流控芯片所用的介质层为光刻胶。本专利技术的数字微流控芯片所用捕获层的材料为光刻胶，捕获层和介质层通过分子间直接相互作用或等离子体可逆键合在一起。本专利技术的数字微流控芯片所用亲疏水层的材料为特氟龙或聚四氟乙烯PTFE水分散液，通过局部剥离技术构建于捕获层上，形成局部亲水化的捕获结构。为了防止液滴的挥发，对液滴包裹油壳或将液滴浸润在油相中。对于不同的单颗粒/单细胞捕获体系，所述贮液池电极单元可以实现液滴体积从1纳升至10微升的变化。为了保证单颗粒/单细胞分析体系中液滴的移动，在液滴中加入表面活性剂用以防止生物黏附。本专利技术的一个优选的实施方式中，所述的数字微流控芯片基本工作流程为：步骤A：将各试剂分别负载于数字微流控芯片的贮液池电极单元内，加入适量的填充油将各液滴包裹住，使用集成电路对电极进行预通电，转入步骤B；步骤B：使用集成电路的控制电路控制电极驱动电路，按一定次序进行电极的通断电控制，从而从贮液池电极单元产生一个合适体积的含颗粒/细胞液滴，通过与其连接的通道电极阵列将液滴移动至单颗粒/单细胞捕获电极处，重复这一过程使各捕获电极均负载含颗粒/细胞液滴，转入步骤C；步骤C：对单颗粒/单细胞捕获电极阵列区电极断电，液滴静置1～3分钟后，使颗粒/细胞在重力作用下沉降于芯片表面，转入步骤D；步骤D：集成电路的控制电路控制电极驱动电路，使液滴从单颗粒/单细胞捕获电极阵列区通过，当单个颗粒/细胞进入微捕获结构中时，因为流体从旁路经过的路径大于从微结构的间隙，颗粒/细胞会先进入微捕获结构的间隙中，由于间隙的宽度小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片，其特征在于：该数字微流控芯片包括具有多层图案的数字微流控芯片和集成电路两部分；所述的具有多层图案的数字微流控芯片包括上、下极板两部分，下极板包括基底、电极层、介质层、捕获层和局部亲水化的疏水层，上极板包括疏水化的电极；集成电路为数字微流控电路控制系统；所述数字微流控芯片的下极板包括基底、电极层、介质层、捕获层和局部亲水化的疏水层，电极层位于基底表面，介质层均匀涂覆于电极层上表面，捕获层结合于介质层上方并与电极层特定位置对准，局部亲水化的疏水层在捕获层上表面，在捕获层周围形成亲水图案，在其余区域形成疏水图案；所述上极板从下至上依次包括疏水层、接地导电层和上极板基底；电极层为具有特定图案的电极阵列，包括电极接入口、贮液池电极单元、液滴生成通道电极阵列、单颗粒/单细胞捕获电极阵列和反应电极区，液滴生成通道电极阵列分别与贮液池电极单元一一相连，并以单颗粒/单细胞捕获电极阵列和反应电极区为中心对称分列于其两侧；捕获层为具有单细胞捕获能力的微结构阵列，由具有小于单颗粒/单细胞尺寸间隙的微结构和流体分布微柱组成，该阵列与电极层特定位置对准；局部亲水化的疏水层经对准在捕获层的微结构处形成亲水化位点。...

【技术特征摘要】
1.一种基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片，其特征在于：该数字微流控芯片包括具有多层图案的数字微流控芯片和集成电路两部分；所述的具有多层图案的数字微流控芯片包括上、下极板两部分，下极板包括基底、电极层、介质层、捕获层和局部亲水化的疏水层，上极板包括疏水化的电极；集成电路为数字微流控电路控制系统；所述数字微流控芯片的下极板包括基底、电极层、介质层、捕获层和局部亲水化的疏水层，电极层位于基底表面，介质层均匀涂覆于电极层上表面，捕获层结合于介质层上方并与电极层特定位置对准，局部亲水化的疏水层在捕获层上表面，在捕获层周围形成亲水图案，在其余区域形成疏水图案；所述上极板从下至上依次包括疏水层、接地导电层和上极板基底；电极层为具有特定图案的电极阵列，包括电极接入口、贮液池电极单元、液滴生成通道电极阵列、单颗粒/单细胞捕获电极阵列和反应电极区，液滴生成通道电极阵列分别与贮液池电极单元一一相连，并以单颗粒/单细胞捕获电极阵列和反应电极区为中心对称分列于其两侧；捕获层为具有单细胞捕获能力的微结构阵列，由具有小于单颗粒/单细胞尺寸间隙的微结构和流体分布微柱组成，该阵列与电极层特定位置对准；局部亲水化的疏水层经对准在捕获层的微结构处形成亲水化位点。2.根据权利要求1所述的基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片，其特征在于：所述的捕获层微结构的间隙的宽度为5-500微米，深度为5-300微米，流体分布微柱随微结构的大小形状变化而变化。3.根据权利要求1所述的基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片，其特征在于：所述的颗粒/细胞的直径在5-200微米。4.根据权利要求1所述的基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片，其特征在于：所述的亲水化位点的形状包括圆形、方形、半月形，随捕获层形状的变化而变化。5.根据权利要求1所述的基于数字微流控技术的全自动单颗粒/单细胞捕获芯片，其特征在于：所用捕获层的材料为光刻胶，捕获层和介质层通过分子间直接相互作用或等离子体可逆键合在一起。6.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，阮庆宇，王杨，邹芬香，林晓烨，许醒，张东锋，周雷激，朱志，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35