一种提高真菌产紫杉醇产率的双液相发酵方法技术

本发明专利技术涉及一种利用双液相发酵提高真菌产紫杉醇的方法。其包括在培养基中培养产紫杉醇真菌拟盘多毛孢（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ　ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）ＮＫ１７，当菌体生长达到平台期，加入有机溶剂继续培养，以使在所述菌株细胞内和所述培养基中更多地产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯紫杉醇。本发明专利技术紫杉醇产率高，生产成本低，发酵周期短，应用于工业化生产，紫杉醇产率可提高２倍。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程和生物制药
具体涉及一种提高真菌产 紫杉醇产率的双液相发酵方法。
技术介绍
紫杉醇(paclitaxd，商品名Taxol)是一种复杂的天然的抗癌药物，属于 二萜生物碱，其基本结构由浆果赤霉素III (baccatin III)和连接其13位碳上一苯丙氨酸 衍生物构成。由于紫杉醇的市场供应受制于原料来源和制备技术两方面的制约，使得药价昂贵。为 此，制药界和学术界一直在寻找新的更好的原料及方法，来代替现有的生产技术，以提高 紫杉醇的产量、满足临床需求。过去十余年中取得的最有意义的进展，是发现了与红豆杉 等植物共生的一些真菌产生紫杉醇，并且其化学结构和生物活性与红豆杉所产紫杉醇完全 相同。1993年，Stierle等从太平洋红豆杉的韧皮部分离到1株内生真菌-安德烈紫杉菌 (7axow_yce m￡^a"ae)，经培养，采用质谱、色谱(TLC/HPLC)和放射性化学标记等方法， 发现该菌的发酵液中存在紫杉醇，尽管产量较低，每升发酵液含紫杉醇24-50 ng。同时还 证实，这些真菌紫杉醇与红豆杉紫杉醇结构和性质完全一样。随后，许多人分离到不同的 产紫杉醇的内共生真菌。我国境内也发现了多种产紫杉醇的内共生真菌。据统计，国内外 已报道的产生紫杉醇真菌种类已超过三十种，这些真菌绝大多数是子囊菌或半知菌，而且 都是内共生真菌。由于目前这些真菌发酵产物中紫杉醇的含量很低，不能达到工业发酵生 产的水平，因此远远不能满足市场的需求。本实验室经过多年大量的深入研究，发现并培 养了一种腐生真菌-拟盘多毛孢尸eWa/o"opw;s w/cra^pora NK-17 (菌种保藏号 CGMCC2694),该菌紫杉醇产量较高，发酵条件容易控制，培养周期短，是一株工业化发 酵生产紫杉醇的优势菌。发酵工业中，除单液相发酵(如氨基酸发酵、酶制剂发酵、有机酸发酵等)占有极重 要位置外，双液相发酵系统在以石油为底物的发酵(如十三碳二元酸生产)及生物制药中 也占有重要位置。目前，发酵生产中双液相发酵体系有三类，第一类是已商品化的以烷烃 或油脂为碳源的发酵体系；第二类是氧载体发酵体系，即将对氧有较高溶解度，但又不溶 于水的有机溶剂(称为氧载体)加入到好氧发酵体系中，加快发酵体系的氧传递速度；第 三类是近几年开始研究的，在上述两类双液相发酵体系中引入一种固体载体(或乳化剂)， 利用这种载体所具有的很强的与水和油的双重吸附能力，增加双液相之间的接触面积，从 而提高传质与发酵产率。本专利技术即提供了一种，利用第一类双液相发酵体系提高真菌拟盘多毛孢生产紫杉醇的 方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术存在的上述不足和满足市场对紫杉醇的需求，提供一种利用双液相发酵提高真菌产紫杉醇的方法。本专利技术提供的一种能生产紫杉醇的菌种是拟盘多毛孢(i^W"/加'o戸"w&my/wr") NK17(菌种保藏号CGMCC2694)。本专利技术所述的利用双液相发酵提高真菌产紫杉醇的方法是在培养基中培养拟盘多 毛孢i^Wa/orio;w/s脂'cmy; oraNKn，当菌体生长达到平台期，加入有机溶剂继续培养， 以使在所述微生物细胞内和所述培养基中产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内和培养基 中回收并提纯紫杉醇。所述的培养基为PDB培养基，其组成为g/L:马铃薯180-220 g，蔗糖20 g，自然pH。所述的菌体培养是在500 mL-lL三角瓶中、需氧条件下进行的发酵培养，接种方式 采用块状菌丝体的接种方式，培养温度为28-30°C ，发酵初始pH值为PDB培养基自然pH，， 培养转速为180-220 rpm 。继续培养中选择加入的有机溶剂是甲醇、乙酸乙酯或三氯甲烷，体积浓度的范围为0.5%-2% 。以上所述的培养可以在本领域的常规或已知的条件下进行。培养时间依培养条件而 定，时间范围为6-10天，菌体生长进入平台期。为了从培养基分离出紫杉醇，可以使用本领域常规或已知的用于从微生物的培养基中 分离代谢物的任何分离方法。例如，菌丝体可以通过离心或过滤从发酵液中分离出来，紫 杉醇可以用一种或一种以上不与水相混的有机溶剂从滤液中萃取出来。另一方面，分离出 的菌丝体中所包含的紫杉醇可以通过例如用一种溶剂(例如甲醇)从菌丝体中提取出来。 所得紫杉醇粗产物可以使用本领域常规或已知的纯化方法纯化，例如色谱法。从所述细胞和培养基中提取和纯化紫杉醇的方法包括以下步骤(1) 将所述培养过程所得液分离出发酵菌体和发酵上清液；(2) 用有机溶剂提取所得发酵菌体，提取液与上步发酵上清液一起进行浓縮；(3) 将第(2)步所得物用色谱纯化的方法纯化，得产物紫杉醇。所述第(1)步中，可以按本领域常规或已知的方法进行分离，例如将所得发酵液离 心或过滤。所述第(2)步中可将所得发酵菌体千燥粉碎后，再用有机溶剂提取。用饱和Na2CCb 溶液调节提取液与发酵上清液的pH值为6.0- 8.0。所述干燥可按照本领域常规或已知的方 法进行，例如真空冷冻干燥法。所述从发酵菌体中提取紫杉醇用的有机溶剂可以是本领域 常规或已知的溶剂，例如甲醇。所述浓縮方法可按照本领域常规或已知的方法进行，例如 减压浓縮。所述第(3)步中的色谱纯化可以按照本领域常规或已知的方法进行，色谱柱填料可 以用C18，流动相可以用甲醇/1120，也可以使用一个以上的色谱柱。本专利技术的优点和积极效果采用本专利技术的双液相发酵生产紫杉醇的方法，产率可以达到551.72 Mg/L，产率高于 现有的组织培养法和微生物发酵法l倍以上。本技术周期短，成本低，产率高，应用于工 业化生产，可解决紫杉醇的工艺问题，即保护了自然资源，又可满足临床用药的需要。附图说明图1是本专利技术中不同种类及配比的双液相系统对拟盘多毛孢NK17菌株紫杉醇产量的 影响。本专利技术提供的能产紫杉醇的新菌株是一株腐生真菌拟盘多毛孢，己于2008年10月8 曰保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址北京市朝阳区大屯路甲3号中国 科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC2694，分类命名尸eWa/o"op^ m/cnw/wra NK17 。具体实施方式下面将通过实施例对本专利技术作进一步的描述，这些描述并不是对本
技术实现思路
作进一步 的限定。本领域的技术人员应理解，对专利技术技术特征所作的等同替换、或相应的改进，仍 属于本专利技术的保护范围之内。实施例1、产紫杉醇菌株NK17的发酵培养用手术刀切取一小块NK17菌丝体接入灭好菌的PDB培养基中，PDB组成为(g/L): 马铃薯180-220 g (如180、 200或220g)，蔗糖20 g，自然pH。菌体培养是在500 mL-lL 三角瓶中，需氧条件下进行的发酵培养，培养温度为28-3(TC，发酵初始pH值为PDB培 养基自然pH,培养转速为180-220 rpm (如180、 200或220 rpm)。待菌体生长达到平 台期后(第7天)，选择加入有机溶剂为甲醇、乙酸乙酯或三氯甲烷，体积浓度的范围为 0.5%-2% 。具体选择加入的有机溶剂为1%甲醇，或0.5%乙酸乙酯，或1%乙酸乙酯，或2%乙 酸乙酯，或0.5%三氯甲烷，或1%三氯甲烷。然后继续培养3 4天。实施例2 、产紫杉醇菌株NK17发酵产物前处理过程将上例发酵产物进行抽滤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高真菌产紫杉醇产率的双液相发酵方法，其特征在于：在培养基中培养拟盘多毛孢Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ　ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ　ＮＫ１７，当菌体生长达到平台期，加入有机溶剂继续培养，以使在所述微生物细胞内和所述培养基中产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯紫杉醇。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱旭东，毕建男，潘皎，严冰，刘志鹏，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]