嗜热厌氧纤维素产氢菌的分离方法技术

嗜热厌氧纤维素产氢菌的分离方法，它涉及一种产氢菌的分离方法。它解决了现有产氢菌的培养方法存在结晶度低、较难降解及培养出的产氢菌产氢率低的问题。分离方法：一、制备菌悬液Ａ；二、制备富集后菌悬液；三、将富集后菌悬液倍比稀释后进行滚管，培养至管中有透明圈出现；四、制备菌悬液Ｂ；五、将菌悬液Ｂ倍比稀释后进行滚管，培养至管中有透明圈出现，然后挑取透明圈菌落再次培养；六、重复步骤三到步骤五５次，即可分离。本发明专利技术分离嗜热厌氧纤维素产氢菌的方法具有结晶度高，容易降解及分离出产氢菌的产氢率约为现有产氢菌产氢率的６～８倍的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种产氢菌的分离方法。技术背景纤维素是自然界中储量最丰富的天然物质，具有品种多，再生时间短等优点。据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的生物质资源高达1.55x109 吨，其中只有很少部分被用作牲畜饲料和农村家用燃料外，而剩下的约89% 尚未被利用或未被合理利用——绝大多数作为环境污染物被废弃而长期滞留 在环境中或者被焚烧，不仅造成环境污染更加的导致了生物质资源的巨大浪 费。氢能是一种无污染、可再生及能量密度高的能源，被公认为是最有吸引力 的替代能源。目前应用纤维素产氢菌的方法中比较普遍和成功为纤维素滤纸球 磨浆法，但是此方法在分离过程中存在结晶度低、较难降解及培养出的产氢菌 产氢率低的问题。
技术实现思路
本专利技术目的是为了解决现有产氢菌的培养方法存在结晶度低、较难降解及 培养出的产氢菌产氢率低的问题。而提供。按以下步骤实现 一、将4.0 6.0g采 集样品放入装有数颗玻璃球的250mL灭菌血清瓶中，然后加入80 120mL灭 菌水，通入氮气后封口，而后以100 200r/min的振速振荡4 6h，得菌悬液 A; 二、取4 6mL菌悬液A转入装有lOOmL纤维素粉固体培养基的250rnL 灭菌血清瓶中，然后在60士2。C的条件下恒温培养5 7天，得富集后菌悬液； 三、取lmL富集后菌悬液然后用无菌厌氧水倍比稀释，然后分别取104倍、 105倍和106倍的稀释液lmL与融化的纤维素粉固体培养基混合均匀后进行滚 管，而后在60士2t:的条件下恒温培养至管中有透明圈出现；四、挑取透明圈 菌落放在纤维素粉液体培养基上，然后在80 90。C的条件下水浴处理8 12min，然后在60i2"C的条件下恒温培养至培养液混浊，得菌悬液B;五、取lmL菌悬液B然后用无菌厌氧水倍比稀释，然后分别取104倍、105倍和106 倍的稀释液lmL与融化的纤维素粉固体培养基混合均匀后进行滚管，而后在 60士2'C的条件下恒温培养至管中有透明圈出现，然后再挑取透明圈菌落放在纤 维素粉液体培养基上培养；六、重复步骤三到步骤五5次，即可分离出嗜热厌 氧纤维素产氢菌。本专利技术采用纤维素粉滚管黏附法分离出嗜热厌氧纤维素产氢菌，在富集物 中将存在数量占优势但纤维素降解活性较弱的种群，利用不溶性纤维素粉更能 有效地分离得到纤维素酶活较强的菌株；纤维素粉(PHIOI Avicel)结晶度高， 与纤维素降解细菌的黏附作用较强且黏附维持时间较长，转接过程二者不易脱 落；分离出来的产氢菌接入到纤维素粉液体培养基中容易降解且大大提高了产 氢率(产氢气量为661.76 808.32mL/L，产氢率约为现有产氢菌产氢率的6 8倍)。附图说明图1为具体实施方式十五中分离的嗜热厌氧纤维素产氢菌扩大一万倍的 原子力电镜照片；图2为具体实施方式十五中分离的嗜热厌氧纤维素产氢菌的 透射电镜照片；图3为具体实施方式十五步骤三中透明圈变化图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方 式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式按以下步 骤实现 一、将4.0 6.0g采集样品放入装有数颗玻璃球的250mL灭菌血清瓶 中，然后加入80 120mL灭菌水，通入氮气后封口，而后以100 200r/min 的振速振荡4 6h，得菌悬液A; 二、取4 6mL菌悬液A转入装有lOOmL 纤维素粉固体培养基的250mL灭菌血清瓶中，然后在60士2。C的条件下恒温培 养5 7天，得富集后菌悬液；三、取lmL富集后菌悬液然后用无菌厌氧水倍 比稀释，然后分别取104倍、10 5倍和106倍的稀释液lmL与融化的纤维素粉 固体培养基混合均匀后进行滚管，而后在60士2。C的条件下恒温培养至管中有 透明圈出现；四、挑取透明圈菌落放在纤维素粉液体培养基上，然后在80 9(TC的条件下水浴处理8 12min，然后在60士2。C的条件下恒温培养至培养液混浊，得菌悬液B;五、取lmL菌悬液B然后用无菌厌氧水倍比稀释，然后 分别取104倍、105倍和106倍的稀释液lmL与融化的纤维素粉固体培养基混 合均匀后进行滚管，而后在60士2'C的条件下恒温培养至管中有透明圈出现， 然后再挑取透明圈菌落放在纤维素粉液体培养基上培养；六、重复步骤三到步 骤五5次，即可分离出嗜热厌氧纤维素产氢菌。本实施方式中所使用的纤维素粉为PH101 Avicd纤维素粉。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中采集样品为固态温泉底泥、固态秸秆堆肥物、多年朽木木屑或固态有机废水厌氧 反应器活性污泥。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中氮气的纯度为99.99%。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中将5.0g采集样品放入装有数颗玻璃球的250mL灭菌血清瓶中，然后加入 100mL灭菌水。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中以 150r/min的振速振荡5h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中纤维素粉固体培养基由l.Og的氯化铵、2.0g的氯化钠、1.5g的磷酸氢二钾、3.5g 的磷酸二氢钾、0.5g的半胱氨酸、0.2g的MgCl2'6H20、 0.2g的氯化钾、2g 的酵母粉、2g的蛋白胨、lmL的微量金属元素贮液、lmL的维生素]T:液、lmL 的浓度为0.196。(w/v)刃天青、10 g/L的纤维素粉、2%的琼脂和1000mL的蒸 馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式六不同的是微量金属元素 贮液由1.5g的氯化亚铁、70mg的氯化锌、6mg的硼酸、O.lg的MnCl2.4H20、 2mg的CuCl2'2H20、 0.19g的CoCl2.6H20、 24mg的NiCl2.6H20、 36mg的 Na2M04'H20、 15mg的钨酸钠和15mg的Na2Se04'5H20溶于lOOOmL的蒸馏 水制成。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式六不同的是维生素贮液由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的烟酸、5.0mg的盐酸硫胺素、50.0mg的对氨基苯甲酸、20.0mg的叶酸、50.0mg的泛酸钙、l.Omg的维生素Bu和 lOO.Omg的盐酸吡哆醇溶于lOOOmL蒸馏水制成。其它步骤及参数与具体实施 方式六相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一或六不同的是步骤二中 取5mL菌悬液A转入装有100mL纤维素粉固体培养基的250mL灭菌血清瓶 中。其它步骤及参数与具体实施方式一或六相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中在 60士2'C的条件下恒温培养6天。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中纤维素粉液体培养基由l.Og的氯化铵、2.0g的氯化钠、1.5g的磷酸氢二钾、3.5g 的磷酸二氢钾、0.5g的半胱氨酸、0.2g的MgCl2'6H20、 本文档来自技高网...

【技术保护点】
嗜热厌氧纤维素产氢菌的分离方法，其特征在于嗜热厌氧纤维素产氢菌的分离方法按以下步骤实现：一、将４．０～６．０ｇ采集样品放入装有数颗玻璃球的２５０ｍＬ灭菌血清瓶中，然后加入８０～１２０ｍＬ灭菌水，通入氮气后封口，而后以１００～２００ｒ／ｍｉｎ的振速振荡４～６ｈ，得菌悬液Ａ；二、取４～６ｍＬ菌悬液Ａ转入装有１００ｍＬ纤维素粉固体培养基的２５０ｍＬ灭菌血清瓶中，然后在６０±２℃的条件下恒温培养５～７天，得富集后菌悬液；三、取１ｍＬ富集后菌悬液然后用无菌厌氧水倍比稀释，然后分别取１０↑［４］倍、１０↑［５］倍和１０↑［６］倍的稀释液１ｍＬ与融化的纤维素粉固体培养基混合均匀后进行滚管，而后在６０±２℃的条件下恒温培养至管中有透明圈出现；四、挑取透明圈菌落放在纤维素粉液体培养基上，然后在８０～９０℃的条件下水浴处理８～１２ｍｉｎ，然后在６０±２℃的条件下恒温培养至培养液混浊，得菌悬液Ｂ；五、取１ｍＬ菌悬液Ｂ然后用无菌厌氧水倍比稀释，然后分别取１０↑［４］倍、１０↑［５］倍和１０↑［６］倍的稀释液１ｍＬ与融化的纤维素粉固体培养基混合均匀后进行滚管，而后在６０±２℃的条件下恒温培养至管中有透明圈出现，然后再挑取透明圈菌落放在纤维素粉液体培养基上培养；六、重复步骤三到步骤五５次，即可分离出嗜热厌氧纤维素产氢菌。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：任南琪，曹广丽，王爱杰，刘冰峰，朱玉红，许继飞，陈川，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]