一种棒状链霉菌、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于微生物工程领域，提供了一种生产克拉维酸的棒状链霉菌高产菌株、制备该菌株的方法及应用，具体涉及通过增加棒状链霉菌菌株克拉维酸合成前体－－精氨酸合成途径中的关键酶基因ａｒｇＧ的拷贝数，使精氨酸的合成途径中的关键酶能够大量表达，从而获得克拉维酸高产菌株棒状链霉菌ＬＮＳＣ－２。利用本发明专利技术提供的菌株发酵生产克拉维酸，其产量比原始菌株高２０％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药领域，涉及一种棒状链霉菌，特别是一种通过基因工程方法构建 的棒状链霉菌。本专利技术还涉及所述棒状链霉菌的制备方法及应用。
技术介绍
(3-内酰胺类抗生素，如青霉素、头孢菌素、头霉素，是临床上应用最广泛的抗生素品 种。但是，由于病原菌耐药性的出现，此类抗生素的使用大受影响。病原菌出现耐药性的 主要原因是其产生的p-内酰胺酶，P-内酰胺酶通过破坏p-内酰胺类抗生素的p-内酰胺环而 使其失活。克拉维酸是棒状链霉菌产生的天然p-内酰胺酶抑制剂，能够不可逆的结合P-内 酰胺酶的丝氨酸活性位点而保护P-内酰胺类抗生素的活性。临床上克拉维酸常与p-内酰胺 类抗生素复配使用，能够有效地增强P-内酰胺类抗生素的抗菌活性及扩大抗菌谱。其中以 阿莫西林/克拉维酸钾复方制剂应用的最为广泛，曾经连续13年位列世界畅销药排行榜。克拉维酸的生产菌为棒状链霉菌6SYj"epto历/ces c"Ki/h'ger"sA目前国内的菌种生 产能力很低，在菌种选育时主要采用传统的方法。传统的菌种选育方法主要是釆用紫外诱 变和化学诱变，这些方法耗时长，随机性大，工作量大，并且很多具有遗传优势和代谢优 势的生物突变种群由于突变的随机性而难以鉴定和分离。国内提高克拉维酸产量的另一途 径主要是优化发酵条件，但其所能提高的产量有限。由于克拉维酸发酵产量低，生产工艺 复杂，化学合成法尚未实现工业化，我国的克拉维酸制剂一直以来主要依赖进口，因此大 幅度提高其生产菌株产酸量是当前克拉维酸制剂开发中的一项重要任务。随着重组基因工程技术的发展，越来越多的研究将其应用于调控生物的代谢途径，特 别是那些具有重要商业价值的工业生产用微生物。微生物细胞在生长代谢过程中，自身会 合理、经济地利用和合成各种能量和物质，使其处于平衡生长状态。然而，相对于生产应 用来说，细胞原有的代谢调控网络是不合适的。为了积累某种代谢产物，更好的应用于生 产，就必须改变原有的代谢调控网络，就需要对代谢途径进行修饰。利用分子生物学原理 系统分析细胞代谢网络，并通过重组DNA技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完 成细胞特性的改造，这就是代谢工程。代谢工程被视为第三代基因工程技术，是继传统的蛋白质多肽多基因表达(第一代基因工程)和基因定向突变(第二代基因工程)之后的一个崭新科学领域。它是分子生物学、 微生物学、遗传学和分子反应动力学等多学科的发展及相互渗透的结果，是国内外研究的 热点。它针对细胞代谢途径个所属反应在基因水平上的表达与调控，利用重组DNA技术扩 增、删除、植入和调控代谢途径相关的基因，从而得到具有优良遗传特性的工程菌。例如， 可以通过增加那些编码合成途径中的限速酶的基因拷贝数来增加目的代谢产物的产量。利 用这种方法在选育高产菌株时针对性强，省时省力。克拉维酸(clavulanic acid， CA)属于次级代谢产物，1978年Elson用C13标记物研 究ca的合成途径，酯酸盐可形成ca分子的一部分五碳骨架(碳2,3及8 ,9 ，10),甘油 可提供e-内酰胺环(碳5,6,7)的碳骨架。随后研究发现，鸟氨酸与精氨酸均可有效掺入 CA (碳2,3 ,8,9,10)。 Valentin等利用不能将精氨酸转变为鸟氨酸的argF、 argG突变株为研究菌株，发现精氨酸为ca的直接前体。标记的甘油、甘油酸、丙酸盐和e-羟基丙酸盐均可掺入到CA (碳5，6，7)，但乳酸或甘油酸二位碳上的氢却不能掺入，说明这两种物质 在掺入前均需被转变成丙酮酸盐。随着CEA合成酶(催化精氨酸和三碳单元的连接)被分 离纯化，研究者发现此酶以D—3—磷酸甘油醛为底物。因此，尽管其它三碳物质可能最终 有不同的利用效率，但显然D—3—磷酸甘油醛是CA分子中三碳单元的直接前体。综上所 述，克拉维酸生物合成前体中，C3单位来源于甘油或它的代谢产物，或其它途径来源的磷 酸烯醇型丙酮酸，但D—3—磷酸甘油醛应该是克拉维酸分子中三碳单元最直接前体物；C5 单位来源于TCA循环的中间物ci 一酮基戊二酸的转化产物——谷氨酸、鸟氨酸和精氨酸， 其最适合的前体物以精氨酸更为直接(见附图1)。目前利用基因工程方法对棒状链霉菌进行改造主要集中于以下几个方面利用基因敲 除的方法中断克拉维酸的竞争代谢途径——头霉素c代谢途径中的基因；利用基因敲 除的方法中断克拉维酸的竞争代谢途径——棒垸类代谢途径中的cv/n基因簇中的基因；利 用基因插入的方法增加克拉维酸代谢途径中的调控基因ca^和c^及的拷贝数；利用基因 插入的方法增加克拉维酸代谢途径中的限速步骤酶基因c必2的拷贝数。但是，对克拉维酸 的合成前体——精氨酸的代谢途径却无人关注，本专利技术就是利用基因工程方法对精氨酸代 谢途径进行了改造。本专利技术将基因工程技术应用于克拉维酸生产菌株的改良，具有非常重要的工业应用价 值。目前，涉及克拉维酸生产及分离精制的先进技术主要由国外大型制药公司掌握，国内 有关克拉维酸的理论和应用方面的研究都比较落后，表现为菌株选育水平、发酵工艺、克 拉维酸提取等关键技术远远落后于国外。因此，如何有效利用技术创新提高克拉维酸产量成为一直困扰着国内生产企业的难题。要提明通过基因工程方法改良生产菌株，来提高克 拉维酸产量，为生产菌种改良提供了新的途径，具有非常重要的意义。
技术实现思路
为了解决棒状链霉菌发酵生产克拉维酸产量低的问题，本专利技术的目的之一是提供一种 生产克拉维酸的棒状链霉菌高产菌株。本专利技术的第二个目的是提供一种制备上述棒状链霉菌的方法。本专利技术的第三个目的是提供上述棒状链霉菌菌株在提高克拉维酸产量中的应用。本专利技术的棒状链霉菌LNSC-2已经于2008年9月22在中国普通微生物菌种保藏管理中心保 藏，并收到保藏登记号CGMCC No. 2670.为了制备上述棒状链霉菌菌株，专利技术人通过增加棒状链霉菌菌株基因组中克拉维酸合 成前体——精氨酸合成途径中的关键酶基因的拷贝数，使精氨酸的合成途径中的关键 酶能够大量表达，从而获得克拉维酸高产菌株。wgG基因编码精氨琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetases, ASS), ASS催化瓜氨 酸和天冬氨酸縮合生成精氨琥珀酸。转入wgG基因后，可促使宿主生成更多的精氨酸，提 高克拉维酸合成时前提物的可获得性，从而提高克拉维酸的产量。本专利技术提供的提高棒状链霉菌LNSC-2生产克拉维酸产量的方法的流程图如附图3所 示，其具体步骤为a. 从棒状链霉菌的总DNA中通过PCR的方法克隆含有wgG基因的片断,或者把wgG 基因插入到带有噬菌体接合点attP位点的载体中，从而得到含有wgG基因片断的重组 载体；b. 将a步所得的重组载体转化到制备好的棒状链霉菌原生质中，抗性筛选得到转化菌 株；c. 检测b步骤得到的棒状链霉菌菌株的产克拉维酸的能力，得到克拉维酸高产的棒状 链霉菌LNSC-2 。根据本专利技术的棒状链霉菌菌株LNSC-2 (CGMCC No. 2670)具有以下微生物学特性 棒状链霉菌LNSC-2 (S&ep^w^ces c/av^/gems LNSC-2)属于放线菌，链霉菌属是最 高等的放线菌。革兰氏阳性，有发育良好的分枝菌丝，菌丝纤细无横隔，宽度近于杆状细 菌，约0.5 1微本文档来自技高网...

【技术保护点】
棒状链霉菌ＬＮＳＣ－２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ　ＬＮＳＣ－０２），保藏号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２６７０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵志全，
申请(专利权)人：鲁南制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]