对大肠杆菌○59的○-抗原特异的核苷酸制造技术

本发明专利技术提供一种对大肠杆菌０５９（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ０５９）的Ｏ－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌０５９中控制Ｏ－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示的分离的核苷酸，全长１０４５０个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的ＳＥＱＩＤＮＯ：１的核苷酸；还包括源于大肠杆菌０５９的Ｏ－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸。本发明专利技术通过ＰＣＲ证实寡核苷酸对大肠杆菌０５９的Ｏ－抗原都有高度的特异性。本发明专利技术还公开了用本发明专利技术的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌０５９的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及大肠杆菌O59(Escherichia coli O59)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O59中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O59并鉴定这些致病菌中的O-抗原。O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。大肠杆菌O59中含有产shiga毒素的stx1基因和致病因子eae基因，大肠杆菌O59能与产毒素的大肠杆菌(Shigatoxin-producing Escherichiacoli，STEC)共同引起人的几种疾病。因此，及时而准确地检出大肠杆菌O59是重要的。本专利技术的一个目的是提供了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。本专利技术的次一目的是提供了构成大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的基因聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orfl、orf3、orf4基因；糖合成路径基因，包括manB、manC基因。本专利技术的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf1、orf3、orf4基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O59的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O59的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O59的O-抗原也是高度特异的。本专利技术的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O59的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O59。本专利技术的再一目的是提供了分离大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的。本专利技术对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQID NO1所示的分离的核苷酸，全长10450个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其由6个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf3、orf4基因；其中所述的wzy基因是SEQ ID NO1中的2552至3721碱基的核苷酸；orf1基因是SEQ ID NO1中的1354至2565碱基的核苷酸；orf3基因是SEQ ID NO1中的3705至4781碱基的核苷酸；orf4基因是SEQ ID NO1中的4919至5962碱基的核苷酸。前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其源于所述的wzy基因或糖基转移酶基因orf1、orf3、orf4基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。源于orf1基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1701至1720碱基的核苷酸和2221至2239碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1396至1414碱基的核苷酸和2354至2372碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的1969至1987碱基的核苷酸和2410至2429碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的2857至2875碱基的核苷酸和3607至3625碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的2676至2694碱基的核苷酸和3379至3397碱基的核苷酸， SEQ ID NO1中的2925至2943碱基的核苷酸和3687至3707碱基的核苷酸；源于orf3基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的4165至4283碱基的核苷酸和4694至4712碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的3914至3933碱基的核苷酸和4535至4552碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的3714至3733碱基的核苷酸和4478至4497碱基的核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对大肠杆菌０５９的Ｏ－抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的分离的核苷酸，全长１０４５０个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，杨静华，冯露，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]