一种利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化乳酸钠制备丙酮酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用乳酸氧化酶或含该酶的完整细胞转化ＤＬ／Ｌ－乳酸制备丙酮酸的方法，该方法包括（１）菌种选择；（２）斜面培养；（３）种子培养；（４）发酵罐培养；（５）收集菌体；（６）转化实验；（７）分离样品等步骤。本发明专利技术具有方法简便，成本低，转化效率高，提取产物方法简单等特点，在丙酮酸工业化生产方面具有很大的应用前景。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物法转化乳酸制备丙酮酸的方法，具体地说涉及一种利用乳酸氧化酶(LOD)或含该酶的完整细胞转化乳酸制备丙酮酸的方法。直到20世纪90年代，工业上生产丙酮酸都沿用霍华德和弗莱瑟(Howard andfraser)1932年在《Org Synth Coll Vol1475-480 Preparation ofpyruvic acid》一文中发表的酒石酸脱水脱羧法，其主要缺点是(1)丙酮酸产率低(对酒石酸质量产率为0.29～0.30g/g)，(2)成本高(8万元/吨)。发酵法生产丙酮酸的研究始于1950年，在已有的文献报道中，许多细菌、放线菌、酵母菌都能直接利用葡萄糖、丙二醇和丙酸发酵生产丙酮酸，但产量最高仅为23g/l。直到1988年，日本东丽工业株式会社的研究人员选育出一系列丙酮酸产量超过50g/l的球拟酵母菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能，但是发酵法的生产周期长、糖酸转化率较低、从发酵混合物中分离丙酮酸一般难以进行，且费用较高。美国专利(49006681990年2月13日)描述了利用醋杆菌(Acetobacter sp.)将D-乳酸氧化制备丙酮酸，转化率虽然很高，但D-乳酸价格昂贵，实现工业化有困难。中国专利技术专利(CN 1125961A1996年7月3日)丙酮酸的制备方法，公开了利用甘醇酸盐氧化酶和过氧化氢酶催化L-乳酸制备丙酮酸的专利。丙酮酸的浓度典型地可达500mM，转化率达96％以上。反应式如下 由于上述反应的副产物过氧化氢能将丙酮酸分解为乙酸和二氧化碳，故该转化过程必需将甘醇酸盐氧化酶与过氧化氢酶共同固定，以分解副产物过氧化氢。并且该酶只能作用于L-乳酸，对消旋体中的D-乳酸无作用。斯凯茨和西蒙(Schinschel and Simon)1993年在《J.Biotechnol.31191-203.Preparation of pyruvate from(R)-lactate with Proteus species.》一文中，利用变形杆菌(Proteus vulgaris)的(2R)-羟基羧化氧化还原酶(HVOR)进行转化乳酸制备丙酮酸的研究工作，利用20g(干重)/L的休止细胞在1h内可转化650mM的R-乳酸生成丙酮酸，转化率为94％。该体系单位时间产率较高，但需加入电子转移体2，6-二磺酸基蒽醌(AQDS)，并且还原态的电子转移体(AQDSred)需要电化学装置再生为氧化态(AQDSox)，所需设备复杂，投资大，成本高。清水(Shimizu)2001年在《J.Mol.Catal.BEnzym.11355-359 Enzymatic productionof pyruvate from fumarate-an application of microbial cyclic-imide transformingpathway》一文中报道了利用一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)存在的环二酰亚胺途径，转化延胡索酸生产丙酮酸的工作，用1％的湿细胞，24h转化100mM延胡索酸生成94mM的丙酮酸。但该方法的底物较贵，成本较高。经检索利用不动杆菌(Acinetobacter sp.)或假单胞菌(Pseudomonas sp.)或其它微生物的乳酸氧化酶(LOD)或完整细胞进行转化乳酸制备丙酮酸的方法(反应体系中不产生过氧化氢)，未见报道。本专利技术的利用乳酸氧化酶(LOD)或含该酶的完整细胞转化DL/L-乳酸制备丙酮酸的方法，其步骤顺序如下(1)菌种选择选用不动杆菌(Acinetobacter sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)之一。(2)斜面培养将上述菌株接种于含有1.5～2.0％的琼脂糖并加有0.2～3％DL/L-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25～45℃培养15～30小时。(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有0.2～3％DL/L-乳酸钠的液体基本培养基(BLM)中，25～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得一级种子。(4)扩大培养以5％(体积比)接种量，接一级种子于300～1000mL含有0.2-3％DL/L-乳酸钠的BLM中，25～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得二级种子。(5)发酵罐培养以5％(体积比)接种量，接二级种子于1.8～8L含有0.2～3％DL/L-乳酸钠的BLM中，25～45℃条件下，培养15～40小时，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与丙酮酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞酶活，至酶活达到最高时，终止发酵培养。(6)收集菌体取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2～3次；再将菌体溶于pH6.0～9.0、20～100mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到50～300克湿细胞/升，或者超声波破碎后，离心得粗酶液，即制成生物催化剂，在4℃储存，备用。(7)转化实验将步骤(6)中的生物催化剂与DL/L-乳酸钠混合，使混合物中DL/L-乳酸钠的浓度达到200～700mM；生物催化剂的浓度湿细胞0.5～8％，粗酶液酶活单位0.5～5U/ml。在5～40℃，pH6.0～9.0条件下，180转/分钟振荡5～30小时，使底物乳酸、生物催化剂与氧气充分混合。(8)分离样品以5,000～10,000转/分离心5～10分钟，分离步骤(7)中生物催化剂，得到上清液即为样品。(9)样品检测待步骤(8)分离完之后，取1～5μL样品进样，利用高效液相(HPLC)测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。上述步骤(1)中所述的菌种选择不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171，和假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC10838，假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452之一。步骤(2)、(3)、(4)、(5)中涉及的菌株使用基本液体培养基(BLM)配方(重量/体积)如下KH2PO40.1％，K2HPO4·3H2O 0.08％，NH4Cl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl2·2H2O 0.005％，酵母粉0.1％，金属离子混合液0.12％。调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方如下(g/L)Na2EDTA，50；ZnSO4·7H2O，20；MnCl2·4H2O，5；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1，；FeSO4·7H2O，5；CuSO4·5H2O，1.5；CoCl2·H2O，1.6；CaCl2·2H2O，5.5。步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度是30～37℃。步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养时间是15～30小时。步骤(2)、(3)、(4)、(5)中DL/L-乳酸钠浓度为0.5～2％。步骤(6)中所述的生物催化剂是指含有分离纯化的乳酸氧化酶、含有酶的完整细胞、乳酸氧化酶的粗酶之一。步骤(7)中所述的生物催化剂粗酶液的酶活单位1～3U/ml，湿细胞浓度是2～6％。步骤(7)中所述的pH范围7.0～8.0。步骤(7)中转化实验的温度为15～30℃。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用乳酸氧化酶（ＬＯＤ）或含该酶的完整细胞转化ＤＬ／Ｌ－乳酸制备丙酮酸的方法，其步骤顺序如下： （１）菌种选择：选用不动杆菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）之一； （２）斜面培养：将上述菌株接种于含有１．５～２．０％的琼脂糖并加有０．２～３％ＤＬ／Ｌ－乳酸钠的固体斜面基本培养基上，２５～４５℃培养１５～３０小时； （３）一级种子培养：将步骤（２）培养的菌株，无菌条件下用接种环接１～２环于２０～１００ｍＬ含有０．２～３％ＤＬ／Ｌ－乳酸钠的液体基本培养基（ＢＬＭ）中，２５～４５℃条件下，在摇床上振荡培养１０～３０小时，制得一级种子； （４）扩大培养：以５％（体积比）接种量，接一级种子于３００～１０００ｍＬ含有０．２－３％ＤＬ／Ｌ－乳酸钠的ＢＬＭ中，２５～４５℃条件下，在摇床上振荡培养１０～３０小时，制得二级种子； （５）发酵罐培养：以５％（体积比）接种量，接二级种子于１．８～８Ｌ含有０．２～３％ＤＬ／Ｌ－乳酸钠的ＢＬＭ中，２５～４５℃条件下，培养１５～４０小时，期间以２，４－二硝基苯肼（ＤＮＰ）与丙酮酸作用生成棕红色２，４－二硝基苯腙的方法检测细胞酶活，至酶活达到最高时，终止发酵培养； （６）收集菌体：取步骤（５）的发酵液５，０００转／分条件下离心５～８分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤２～３次；再将菌体溶于ｐＨ６．０～９．０、２０～１００ｍＭ的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到５０～３００克湿细胞／升，或者超声波破碎后，离心得粗酶液，即制成生物催化剂，在４℃储存，备用； （７）转化实验：将步骤（６）中的生物催化剂与ＤＬ／Ｌ－乳酸钠混合，使混合物中ＤＬ／Ｌ－乳酸钠的浓度达到２００～７００ｍＭ；生物催化剂的浓度：湿细胞０．５～８％，粗酶液酶活单位０．５～５Ｕ／ｍｌ；在５～４０℃，ｐＨ６．０～９．０条件下，１８０转／分钟振荡５～３０小时，使底物乳酸、生物催化剂与氧气充分混合； （８）分离样品：以５，０００～１０，０００转／分离心５～１０分钟，分离步骤（７）中生物催化剂，得到上清液即为样品； （９）样品检测：待步骤（８）分离完之后，取１～５μＬ样品进样，利用高效液相（ＨＰＬＣ）测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许平，马翠卿，魏中浩，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]