一种人胎盘滋养层细胞系及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种人胎盘滋养层细胞系，于２００５年９月２２日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１４６１。该人胎盘滋养层细胞系是通过下述步骤建立的：从人正常妊娠６－７周的胎盘组织中分离到细胞滋养层细胞；从中筛选出具有增殖能力的细胞群；经过端粒酶催化亚基基因转染，获得了４个具有端粒酶活性的长寿命的细胞株。本发明专利技术建立的细胞系具备正常细胞的增殖特性和人类细胞滋养层细胞的生化功能，而且在裸鼠中不致瘤；同时细胞生长活跃，已经达到２１０世代，是一种永生化的人正常细胞滋养层细胞系，可用作筛选抗生育药物和治疗妊娠相关疾病药物的靶细胞模型，也为进一步研究人滋养层细胞功能提供了理想的体外模型，为研究胚胎植入和妊娠发生生理及病理机制的重要基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞系，具体地说是涉及一种人胎盘细胞滋养层细胞系，及其用途。
技术介绍
妊娠过程中，胎盘是维系母体和胎儿之间营养和物质交换的重要内分泌器官，是胎儿发育和妊娠维持得以成功的重要保障。胎盘中最主要的组成细胞是滋养层细胞，包括单核的具有活跃增殖能力的细胞滋养层细胞(CTB)和多核的承担主要内分泌功能的合体滋养层细胞(STB)，STB是由CTB经过细胞膜融合而形成的。从妊娠初始到结束，胎盘的大部分功能是由滋养层细胞来执行的。胚胎植入时，依靠滋养层细胞与子宫内膜的识别、粘附和侵润，种植并锚定到子宫内；同时滋养层细胞分泌多种激素、细胞因子等维持胚胎的正常发育和母胎间的营养和物质交换；妊娠结束时，滋养层细胞通过产生蛋白酶等促使胎盘从子宫上剥离。临床上，许多妊娠相关疾病都与滋养层细胞功能障碍有关，如自发流产、先兆子痫、葡萄胎、绒毛膜上皮癌等。因此，在胚胎植入和妊娠发生的生理及病理研究中，滋养层细胞功能调节的研究是关键的中心环节。近一个世纪以来，很多学者致力于建立人胎盘滋养层细胞的体外培养体系，以获得能够模拟正常生理条件下滋养层细胞的功能调节的研究模型。最常用的是绒毛膜上皮癌细胞系，如Jar，JEG，BeWo，NUC-1，HCCM-5等在文献1Ringler GE，Strauss JF III(1990)In vitro system for the study of human placental endocrine function.Endocr Rev 11，105-123中所述，它们虽然在某些内分泌功能上与正常滋养层细胞有一定的相似之处，但大部分功能调节尤其是增殖调节方面与正常细胞截然不同。Ho等在文献2Ho CK，Chiang H，Li SY，Yuan CC，Ng HT(1987)Establishment and characterization of atumorigenic trophoblast-like cell line from a human placenta.Cancer Res 47，3220-3224.中报道了一种来自于正常足月胎盘的滋养层样细胞系-TL，但该细胞不能合成多种胎盘来源的激素，而且细胞形态和特性不均一，具有非整倍体染色体核型，在免疫功能缺陷的裸鼠中能够引发肿瘤产生，因而被认为是一群肿瘤化的非正常滋养层细胞系。1992年，Lei等在文献3Lei KJ，Gluzman Y，Pan CJ，Chou JY(1992)Immortalization ofvirus-free human placental cells that express tissue-specific functions.Mol Endocrinol 6，703-712中，用温度敏感型的猴病毒SV40大T抗原基因转化人细胞滋养层细胞，获得几株细胞，它们在37℃的培养条件下，能够以肿瘤细胞的方式无节制增殖，在40℃培养条件下，增殖方式类似于正常细胞，但其激素分泌和调节方式却与正常滋养层细胞不尽相同，因此这些细胞仍然无法作为正常细胞滋养层细胞的代表。事实上，到目前为止，国际上还没有建立人正常滋养层细胞系，尽管众多的学者付出了极大的努力。这主要是由于将人作为研究对象，伦理问题导致获得人胎盘组织这一研究材料有一定的障碍(尤其在西方国家)，同时由于人的个体差异性很大，导致了来自于不同研究者的结果相互矛盾。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种永生化的、保持正常滋养层细胞功能的人胎盘滋养层细胞系，及其用途。本专利技术的目的是通过如下的技术方案实现的本专利技术提供的人胎盘滋养层细胞系，是通过下述步骤建立的从人正常妊娠6-7周的胎盘组织中分离到细胞滋养层细胞；从中筛选出具有增殖能力的细胞群；经过端粒酶催化亚基基因转染，获得了4个具有端粒酶活性的长寿命的细胞株B6Tert-1、B6Tert-2、B6Tert-3和B6Tert-4。本专利技术建立的B6Tert-1细胞，已于2005年9月22日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1461。对B6Tert-1细胞进行生化和增殖特性的鉴定细胞形态观察倒置相差显微镜下观察，B6Tert-1细胞在培养皿中保持单层生长，为多角型的上皮样细胞，细胞为单核，每个细胞中含有1-5个核仁；在长期培养过程中很少观察到多核细胞；当细胞接种密度较低时，一些细胞可以伸拉得很长，用延伸的伪足样结构联系相距较远的细胞，如图1所示。这种均一的细胞形态一直保持到210世代，并能够继续延续。本专利技术建立的B6Tert-1细胞具备正常细胞的增殖特性和人类细胞滋养层细胞的生化功能，而且在裸鼠中不致瘤；同时细胞生长活跃，已经达到210世代，是一种永生化的人正常细胞滋养层细胞系，可用作筛选抗生育药物和治疗妊娠相关疾病药物的靶细胞模型，也为进一步研究人滋养层细胞功能提供了理想的体外模型，为研究胚胎植入和妊娠发生生理及病理机制的重要基础。附图说明图1为在相差倒置显微镜下观察到的B6Tert-1细胞；其中，(A)为80世代的B6Tert-1细胞；(B)为接种密度较低时的B6Tert-1细胞，可伸出长的伪足样结构(*)；标尺为25μm。图2为核酸印迹分析显示B6Tert-1细胞中hCGα和hCGβmRNA的表达，以胎盘绒毛(Placenta villi)来源的RNA作为阳性对照，管家基因GAPDH作为内参照。图3为RT-PCR分析显示B6Tert-1细胞中多种MMPs和TIMPs mRNA的表达模式，以胎盘绒毛组织(Placenta vill)来源的RNA作为阳性对照，管家基因GAPDH作为PCR反应的内参照。具体实施例方式实施例1.B6Tert-1细胞系的建立首先从妊娠6-7周龄的人工流产胎盘(此时也可以称之为绒毛)中分离细胞滋养层细胞。从计划生育门诊获得无菌的绒毛组织3-5个，于冰浴中带回实验室；以下操作均在无菌操作台上进行。将组织置于预先冷却到4℃的PBS缓冲液中，洗去沾染的血块；将组织转移到新鲜的PBS缓冲液中，于解剖镜下分离绒毛和基底膜并弃去基底膜；收集绒毛并剪碎成2-3mm3的小块，转移到50ml离心管内，加入含有0.2-0.3％的胰蛋白酶(美国Sigma公司)的PBS缓冲液20ml，混匀后于4-9℃消化30-50min；离心(1000rpm，5min)后弃去上请液，加入20ml新鲜的FD培养液和终浓度为20-40IU/mL的DNA酶(美国GIBCO公司)，常温下消化5-15min；离心(1000rpm，5min)后弃去上请液，加入20-40ml新鲜的FD培养液悬浮组织，经150目尼龙网过滤，离心(1000rpm，5min)收集细胞；加入2mlFD培养液悬浮细胞，同时在10ml离心管中制备1.25％-2.5％的BSA密度梯度(下层为2ml配制于FD培养液的2.5％BSA溶液，上层为2ml配制于FD培养液的1.25％BSA溶液)，将细胞悬液小心加入BSA密度梯度上层，保持直立并在室温下沉降30-60min；收集最下层的细胞，用FD培养液悬浮后，按照2-4X105/皿的密度接种于涂有6-10μg/cm2Cellmatrix(I型胶原，日本Osaka生物化学研究所)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人胎盘滋养层细胞系，于２００５年９月２２日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ１４６１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王雁玲，庄临之，仇巍，李玉侠，李荣皓，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]