本发明专利技术公开了一株肺炎克雷伯氏菌及其应用。本发明专利技术从广东肇庆古森林土壤样品中分离纯化得到一株肺炎克雷伯氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｎｏｎｉａｅ ＭＦＣ４），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：ＣＧＭＣＣ ２４５４。本发明专利技术同时提供了所述菌株的筛选方法以及在Ｆｅ（Ⅲ）或腐殖酸还原方面的应用，所述菌株能还原结晶度较高的铁氧化物例如纤铁矿、赤铁矿等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于新菌种筛选技术及环境生物
，具体涉及一株肺炎克雷伯氏菌(^r/e&nW/fl/meMAm m'aeMFC4)及其在Fe(ni)还原和腐殖酸还原中的应用。
技术介绍
Fe(III)和腐殖酸是沉积物、土壤等生态环境中大量存在的物质。 Fe(in)主要以难溶性氧化铁形式存在，在地壳中的平均含量约为 5.6%;腐殖酸是腐殖质中溶于碱不溶于酸的部分，富含醌基，非均相 的天然有机混合物。厌氧条件下， 一些微生物能够通过生理生化反应 氧化有机物，同时将Fe(in)氧化物或腐殖酸还原，并获得能量进行生 长。这类微生物被称为Fe(in)或腐殖酸还原菌。微生物对Fe(m)和腐殖酸的还原作用在元素的生物地球化学循 环过程中均具有重要意义，具体表现为1) Fe(ni)或腐殖酸还原菌在 还原Fe(ni)或腐殖酸的过程中，可直接将环境中的有机质或甲苯、氯 乙烯等环境有毒物质氧化，产生C02，参与碳循环。2)还原产物 Fe(II)或还原态腐殖酸能够与环境中的一些氧化态有毒有害物质 (Cr(VI)、 U(VI)、硝基芳香化合物、偶氮染料和多卤代污染物)发生 化学氧化还原反应，从而降低这些物质的毒性。因此，微生物对两种 物质的还原作用影响到环境中C、 N、 Fe、 Mn以及一些痕量金属元 素的生物地球化学循环，并且能够促进重金属以及有机污染物的脱毒。Fe(in)或腐殖酸还原菌在水体自净、污染土壤原位修复、污水处 理中的潜在作用已经引起广泛关注。自19世纪80年代以来，陆续从土壤、沉积物、水体及污泥中分 离到上百种Fe(ni)还原菌，包括地杆菌、希瓦氏菌、产甲垸菌、发酵 细菌、嗜热菌等；20世纪90年代，多种以腐殖酸或腐殖酸模式物蒽 醌-2，6-二磺酸(AQDS)为末端电子受体的细菌也被分离和鉴定，其 中部分菌株也具有Fe(m)还原功能。但已报道的同时具备Fe(III)还原 和腐殖酸还原功能的菌株为数不多，且目前尚未发现肺炎克雷伯氏菌 能够厌氧还原Fe(III)还原和腐殖酸。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的具有Fe(m)/腐殖酸还原功能的 高效菌株肺炎克雷伯氏菌(^T/e^yzW/fl/w^/mom'ae MFC4)。本专利技术的另一个目的在于提供上述肺炎克雷伯氏菌在Fe(III)氧 化物和腐殖酸还原中的应用。本专利技术经大量试验研究，从广东肇庆古森林土壤样品中分离纯化 得到一株肺炎克雷伯氏菌，具有较强的Fe(m)/腐殖酸还原能力，本 专利技术提供所述肺炎克雷伯氏菌在Fe(m)或腐殖酸还原方面的应用。本专利技术提供的肺炎克雷伯氏菌(f&ZwW/fl /w /mww'ae MFC4或 K. p"e"mom^ MFC4)，于2008年4月14日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC2454。本专利技术所述肺炎克雷伯氏菌的富集、分离及纯化方法包括以下步骤:(1) 富集所述富集是移取或称取古森林土壤样品接种到液体分离培养基中；往培养液中鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)，鼓气完毕后将 培养物置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20)静置培养。检测Fe(II)的产 率同时观察培养液的颜色变化情况。当Fe(II)的产量不断增加时，培. 养液的颜色从原先的橙黄色逐渐变暗，最后变成黑色。当Fe(n)的产 量超过总铁含量的50%时，以10%的接种量转接至另一新鲜的培养基 中，上述操作反复三次。每升液体分离培养基中含l.Og葡萄糖、16g柠檬酸铁、2.5g NaHC03、 0.25gNH4Cl、 0.678g NaH2P04.2H20、 O.lgKCl、维生素溶 液10.0mL和微量元素溶液10.0mL。其中，维生素溶液是每升水中含2.0mg生物素、2.0mg叶酸、 10.0mg维生素B6、 5.0mg硫胺素、5.0mg核黄素、5.0mg烟酸、5.0mg 泛酸钙、0.1mg维生素B12、 5.0mg对氨基苯甲酸和5.0mg硫辛酸。所述微量元素溶液是每升水中含1.5g氨三乙酸、3.0g MgS04.7H20、 0.5g MnS04.H20、 l.Og NaCl、 O.lg FeS04-7H20、 O.lg CoCl2.6H20、 O.lg CaCl2、 O.lg ZnS04.7H20、 O.Olg CuS04.5H20、 O.Olg A1K(S04)2.12H20、 O.Olg H3B03和O.Olg Na2Mo04.2H20。(2) 纯化将第四代富集反应后的培养液进行适当稀释后均匀涂布于固体 的分离培养基上(固体分离培养基为每升液体分离培养基中加入18g 琼脂粉)，置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20)培养，挑取单菌落进行单菌落分离与纯化。本专利技术采用以下方法来验证所述菌株的Fe(m)还原功能。 从保存本专利技术菌株的斜面接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30°C， 180转/分钟条件下摇床活化菌体16 24小时，使细菌数量达到指数生长期，得细菌悬浮液。1) 按照分离培养基配方与方法，添加不同有机物(甲酸、乙酸、 丙酸、乳酸、柠檬酸、乙醇、丙三醇、葡萄糖或蔗糖)和铁氧化物(水 铁矿、针铁矿、纤铁矿或赤铁矿)，以10%的接种量接种活化菌液于 液体的分离培养基中，厌氧工作站(N2/CO2=80/20)下3(TC静置培养；2) 每隔一定时间(约5 10天)取4mL培养液于16mL0.5MHCl 溶液中180转/分钟震荡1.5小时；把菌体等沉淀滤掉，采用邻菲罗林 法给滤液中的Fe(II)显色，采用紫外分光光度计在510nm处测定Fe(II) 的含量，验证菌株的铁还原活性。本专利技术的有益效果是提供了一株新的具有Fe(m)还原和腐殖酸 还原能力的菌株，与已报道菌株相比，所述肺炎克雷伯氏菌菌株具有 较强的Fe(ni)还原和腐殖酸还原能力，能还原结晶度较高的铁氧化物 例如纤铁矿、赤铁矿等。 附图说明图1为肺炎克雷伯氏菌(K/^w7W/fl /we"mom'fle MFC4)的20000倍扫描电子显微镜图片 具体实施例方式实施例l肺炎克雷伯氏菌的富集、分离及纯化移取5mL或称取5g古森林土壤样品接种到液体分离培养基中； 往培养液中鼓充高纯混合气体(N2/CO2=80/20)，鼓气时间不少于30 分钟，，鼓气完毕后将培养物置于厌氧工作站(N2/CO2=80/20) 3(TC静 置培养。检测Fe(II)的产率同时观察培养液的颜色变化情况。当Fe(n) 的产量不断增加时，培养液的颜色从原先的橙黄色逐渐变暗，最后变 成黑色。当Fe(n)的产量超过总铁含量的50%时，以10%的接种量转 接至另一新鲜的培养基中，上述操作反复三次。每升液体分离培养基中含l.Og葡萄糖、16g柠檬酸铁、2.5g NaHC03、 0.25gNH4Cl、 0.678g NaH2P04.2H20、 O.lgKCl、维生素溶 液10.0mL和微量元素溶液10.0mL。其中，维生素溶液是每升水中含2.0mg生物素、2.0mg叶酸、 10.0mg维生素B6、 5.0mg硫胺素、5.0mg核黄素、5.0mg烟酸、5.0mg 泛酸钙、0.1mg维生素B12、 5.0mg对氨基苯甲酸和5.0mg硫辛酸；所述微量元素溶液是每升水中含1.5g氨三乙酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株肺炎克雷伯氏菌ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２４５４。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周顺桂，王跃强，武春媛，庄莉，李芳柏，
申请(专利权)人：广东省生态环境与土壤研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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