一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法以及辅助显色剂技术

本发明专利技术为一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法以及辅助显色剂，涉及一种用于辅助光学显微镜在线传感分析抗坏血酸浓度的显色剂，所述显色剂为液态显色剂，由包括羟基氧化钴和3,3',5,5'‑四甲基联苯胺的原料混合而成。本发明专利技术同时提供了一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法，该方法利用显微镜拍摄透明毛细管中显色剂与不同浓度抗坏血酸混合后的照片，通过软件处理将图像信号转化为数字信号，数字信号与抗坏血酸浓度呈现一定线性关系，从而实现对抗坏血酸的浓度检测。本发明专利技术提供的显色剂原料易得，制备简便，可以快速、实时连续的分析抗坏血酸变化情况，具有应用于监测活体脑神经生理过程中抗坏血酸变化情况的能力，并对建立其它光学传感体系方法具有一定的指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法以及辅助显色剂
本专利技术属于纳米材料和分析化学领域，涉及一种抗坏血酸光学检测方法。
技术介绍
抗坏血酸是一种可水溶的六碳糖酸，也是一种重要的神经调质，生理条件下有两个可解离的质子(pKa＝4.04,11.34)。其具有的给电子性质使其在细胞内成为著名的小分子抗氧化剂和自由基清除剂，且部分疾病与抗坏血酸的水平有密切联系。因此，开发一种实时监控生理病理过程中抗坏血酸变化情况的传感方法具有实际意义。目前关于抗坏血酸的含量的测定已有众多利用电化学检测抗坏血酸的方法，如恒电位分析法、差分脉冲伏安法、循环伏安法等。此外主要还有高效液相色谱法(HPLC)、HPLC-电化学检测联用法、毛细管电泳法、紫外比色法及荧光光谱法等。已报道文献中可实现在线分析的，主要以电化学方法为主，少有报道光学在线体系。光学分析方法检测抗坏血酸具有检测范围大、快速、简便、误差小等优点。但同时存在检测限高、反应时间长，难以连续和操作麻烦等问题。目前已报道的光学在线体系中较为突出的一个工作是，赵美萍等结合显微镜拍照功能，及利用纳米金交联HS-PEG-COOH及带有荧光基团的GSH-FITC的纳米探针实现了对S2-离子及大鼠脑内H2S的实时在线检测。在其工作中，设计了一种微流控芯片来连续混合探针、S2-离子样品/大鼠脑透析液及石蜡油，混合后引流至显微镜下的石英毛细管中拍照，并处理图像以得到荧光强度值。该工作虽可灵敏检测生理活性物质，但其基于荧光发光原理，对实验中环境光要求较多，且还未有更简单的、基于可见光吸收的光学在线传感体系的报道。
技术实现思路
为了克服上述技术缺陷，本专利技术提供一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法。本专利技术提供的显色剂以及方法可连续、快速、简单、灵敏地检测抗坏血酸。本专利技术首先提供了一种用于辅助光学显微镜在线传感分析抗坏血酸浓度的显色剂，所述显色剂为液态显色剂，由包括羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的原料混合而成。由于羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺混合后，原本呈现无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液被羟基氧化钴氧化，氧化态的3,3',5,5'-四甲基联苯胺呈现蓝色，溶液体系呈现蓝色；当溶液体系中通入抗坏血酸时，蓝色的氧化态3,3',5,5'-四甲基联苯胺被抗坏血酸还原为无色的还原态3,3',5,5'-四甲基联苯胺，溶液体系变为无色。在此过程中溶液体系的光强度值会发生变化，并可被光学显微镜捕捉、拍摄。本专利技术依据上述反应以及颜色的变化实现对抗坏血酸的检测。为了提高检测的精确度，本专利技术优选在制备所述显色剂时，羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的摩尔用量比为(1～1)：(3～1)。为了能准确检验1～50μM浓度范围内的抗坏血酸，本专利技术优选所述显色剂由浓度35～45μg/mL的羟基氧化钴混悬液与浓度1.5～2.5mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比(1～2)：(1～2)混合而成，更优选地，所述显色剂由浓度40μg/mL的羟基氧化钴混悬液与浓度2.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比1:1混合而成。为了使3,3',5,5'-四甲基联苯胺能够与羟基氧化钴充分作用，以便于显色充分，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中可加入缓冲剂和螯合剂，优选加入柠檬酸和乙二胺四乙酸。作为一种优选方案，所述柠檬酸在所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中的终浓度为1～10μmol/L、优选为5μmol/L，所述乙二胺四乙酸在在所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中的终3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中的浓度为0.4～0.6mmol/L、优选为0.5mmol/L。作为本专利技术的一种优选方案，所述显色剂由浓度35～45μg/mL的羟基氧化钴混悬液与浓度1.5～2.5mmol/L的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比(1～2)：(1～2)混合而成；所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中含有浓度为1～10μmol/L的柠檬酸和浓度为0.4～0.6mmol/L的乙二胺四乙酸。作为本专利技术的一种优选方案，所述显色剂由浓度40μg/mL的羟基氧化钴混悬液与浓度2.0mmol/L的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比1:1混合而成；所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中含有浓度为5μmol/L的柠檬酸和浓度为0.5mmol/L的乙二胺四乙酸。其中，所述羟基氧化钴混悬液可由下述方法制得：将氯化钴与氢氧化钠加入水中，超声处理，再加入次氯酸钠，超声处理，得到深棕色的混合溶液，离心，过滤得到羟基氧化钴纳米片；再将羟基氧化钴纳米片溶于水中配制得到羟基氧化钴混悬液。其中，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液可由如下方法制得：常温下，先将3,3',5,5'-四甲基联苯胺粉末溶于有机溶剂中直至完全溶解，得到混合液A；再将柠檬酸和乙二胺四乙酸溶于水得到混合液B，将混合液A与混合液B混匀，即得3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液。其中，所述有机溶剂可选用二甲亚砜DMSO。本专利技术同时提供了一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法，该方法利用本专利技术提供的显色剂实现。所述方法的流程示意图如图1A所示，利用所述显色剂对抗坏血酸浓度进行检测的原理示意图如图1B所示。具体而言，本专利技术提供的方法包括如下步骤：(1)将本专利技术提供的显色剂与空白对照液持续等速同步通入固定在光学显微镜下的透明毛细管中，用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照，用图像分析软件将连续拍照所得的各张照片的光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I0；(2)将n份不同浓度的抗坏血酸标准品分别与所述显色剂持续等速同步通入所述透明毛细管中，采用与步骤(1)相同的方法进行拍照、信号转化后，得到n个光强数值I1，I2……In-1，In，分别求得与I0的光强差值I1-I0，I2-I0……In-1-I0，In-I0；(3)以所述n份标准品的浓度为横坐标、相应的光强差值为纵坐标，在平面直角坐标系中做图，得到回归曲线；(4)将待测抗坏血酸样品与所述显色剂持续等速同步通入所述透明毛细管中，采用与步骤(1)相同的方法进行拍照、信号转化后，得到光强数值Ix，求得与I0的光强差值Ix-I0；(5)将所述光强差值Ix-I0代入步骤(3)所得回归曲线中，求得浓度，即为待测抗坏血酸样品的浓度。本专利技术所述空白对照液是指抗坏血酸标准品或待测抗坏血酸样品的空白对照液，具体为去离子水。作为本专利技术的一种优选方案，抗坏血酸的检测限为1～50μM。基于此，所述标准品的份数n为3～10，浓度在1～50μM的范围内；优选地，所述标准品的份数为5，浓度分别为1μM、5μM、10μM、20μM以及50μM。为了提高检测的准确性，本专利技术对检测过程中的涉及的具体参数进行全面优化。具体而言：所述光学显微镜的拍摄模式优选为物镜40X、手动放大1.6X，黑白模式。所述透明毛细管的内径优选为200～300μm，更优选为240～260μm。所述显色剂与空白对照、显色剂与标准品或显色剂与待测样品的通入速度均为1～5μL/min，优选为3μL/min。所述显色剂与空白对照、显色剂与标准品或显色剂与待本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于辅助光学显微镜在线传感分析抗坏血酸浓度的显色剂，其特征在于，所述显色剂为液态显色剂，由包括羟基氧化钴和3,3',5,5'‑四甲基联苯胺的原料混合而成。

【技术特征摘要】
1.一种用于辅助光学显微镜在线传感分析抗坏血酸浓度的显色剂，其特征在于，所述显色剂为液态显色剂，由包括羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的原料混合而成。2.根据权利要求1所述的显色剂，其特征在于，所述显色剂中，羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的摩尔比为(1～1)：(3～1)。3.根据权利要求1或2所述的显色剂，其特征在于，所述显色剂中还含有缓冲剂和/或螯合剂；优选地，所显色剂中还含有柠檬酸、乙二胺四乙酸中的一种或两种。4.根据权利要求1所述的显色剂，其特征在于，所述显色剂由浓度35～45μg/mL的羟基氧化钴混悬液与浓度1.5～2.5mmol/L的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比(1～2)：(1～2)混合而成；所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中含有浓度为1～10μmol/L的柠檬酸和浓度为0.4～0.6mol/L的乙二胺四乙酸；优选地，所述显色剂由浓度40μg/mL的羟基氧化钴混悬液与浓度2.0mmol/L的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比1:1混合而成；所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液中含有浓度为5μmol/L的柠檬酸和浓度为0.5mol/L的乙二胺四乙酸。5.一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将权利要求1～4任意一项所述显色剂与空白对照液持续等速同步通入固定在光学显微镜下的透明毛细管中，用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照，用图像分析软件将连续拍照所得的各张照片的光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I0；(2)将n份...

【专利技术属性】
技术研发人员：林雨青，王超，丁永奇，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：北京,11