本发明专利技术涉及维持血尿酸水平的关键基因－ｈＵＲＡＴ１第三内含子ＳＮＰ位点＋１１Ｇ＞Ａ的发现。内容包括：原发性高尿酸血症患者以及正常人群的收集；常规方法提取外周血；根据目的基因设计特异性的引物，ＰＣＲ扩增获得目的基因；将ＰＣＲ产物纯化后测序；应用ｈａｐｌｏｖｉｅｗ软件检验研究对象ＳＮＰ Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡，确认研究对象选取的随机性及两两ＳＮＰ位点之间的连锁关系；应用Ｘ２检验比较不同组别基因型及等位基因频率，确定与原发性高尿酸血症相关的ＳＮＰ及突变位点；应用Ｐｈａｓｅ软件进行与原发性高尿酸血症相关的ＳＮＰ位点所组成的单倍型分析，确定原发性高尿酸血症易感单倍型；应用Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析和不同组别间生化指标的比较，确认原发性高尿酸血症的致病位点。结果显示我们在汉族人群中新发现的ｈＵＲＡＴ１第三内含子的ＳＮＰ位点＋１１Ｇ＞Ａ与高尿酸血症易感性的提高显著相关。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术为与血液中尿酸水平密切相关的hURATl基因第三内含子SNP位点+11 G〉A，涉 及生物医学高技术中新基因的开发与应用领域。
技术介绍
尿酸是人体嘌呤代谢的终末产物，肾脏是尿酸排泄的主要途径。肾脏对尿酸的排泄主要 取决于肾小管腔和基底膜侧尿酸重吸收、分泌转运体的数目和活性。有关资料显示，肾小管对尿酸的重吸收增加是人类高尿酸血症的主要原因，而hURATl作为最重要的尿酸盐重吸收 转运体，被认为是调节血尿酸水平的关键蛋白。hURATl基因属于有机离子转运家族SLC22，该基因位于11ql3，含有10个外显子和9 个内含子。hURATl为阴离子交换通道，通过与乳酸等有机阴离子及氯等无机阴离子交换， 将肾小管管腔内的尿酸转运到肾小管上皮细胞内。临床资料显示，hURATl基因多态性与原发性高尿酸血症密切相关。GraesslerJ等研究发 现，hURATl基因第二外显子C426T多态性与德国人群肾尿酸排泄减少和高尿酸血症显著相 关，相对于CC基因型，CT和TT基因型个体肾脏尿酸排泄分数(FEUA)明显降低，血尿 酸水平明显升高；YukioShima等研究发现，日本男性受试者中hURATl第四内含子G/T多 态不同基因型者(GGGT和TT)血尿酸水平明显不同，GG基因型者血尿酸水平最高，GT 基因型者次之，TT基因型者最低，提出在日本人群中，该SNP位点可作为独立的高尿酸血 症预测标记。Vdzquez-Mellado等对69名墨西哥原发性痛风患者及其29名一级家属和120名 健康个体的hURATl基因进行序列分析，结果显示69名痛风患者中16名患者存在hURATl 基因突变，占患者的23%，其中5种突变位于第5外显子，l种突变位于第4外显子，16名 突变患者中有11名为第5外显子的C850G错义突变，提出上述突变可能与原发性痛风有关。单核苷酸多态性是人类遗传变异的主要来源，众多研究证明单核苷酸多态性影响多基因 遗传病个体的易感性。高尿酸血症是一种多基因遗传病，hURATl作为高尿酸血症的候选基 因，其单核苷酸多态性在导致高尿酸血症中发挥重要的作用。单核苷酸多态性在不同人群中 分布不同，在中国人群中没有高尿酸血症和hURATl基因单核苷酸多态性的相关性报道。本 研究中，我们选择568名中国北方汉族人群hURATl基因10个外显子和9个内含子进行测序，以期发现中国北方汉族人群中与高尿酸血症相关的hURATl基因单核苷酸多态性。 专利技术目的选择原发性高尿酸血症病人227例，对照组341例。取所有研究对象外周抗凝血，提取 基因组DNA。设计特异性引物，采用PCR方法分别扩增hURATl基因启动子、10个外显子 及外显子和内含子交界处,进行正向和反向测序，应用Genestar软件寻找SNP及突变位点；应 用haploview软件检验研究对象SNP Hardy-Weinberg平衡，确认研究对象选取的随机性及两 两SNP位点之间的连锁关系；应用乂2检验比较不同组别基因型及等位基因频率，确定与原 发性高尿酸血症相关的SNP及突变位点;应用Phase软件进行与原发性高尿酸血症相关的SNP 位点所组成的单倍型分析，确定原发性高尿酸血症易感单倍型；应用Logistic回归分析和不 同组别间生化指标的比较，确认原发性高尿酸血症的致病位点,从而为高尿酸血症的基因治疗 以及新药筛选等提供可能的理论指导和依据。内容与要求-研究对象中高尿酸血症组患者的收入标准普通饮食并排除心、肝、肾以及全身性疾病 的基础上，连续三次测定男性及绝经后女性血清中尿酸含量超过416umol/L,绝经前女性超过 357 umol/L。正常对照组收入标准血脂、肾功能、肝功能、尿酸值(各项生化指标)均在 正常范围内的无高尿酸血症家族史正常人。利用常规方法提取患者外周血的基因组DNA，结 合PCR方法获得目的片段，纯化后测序，与正常人相比较，寻找SNP位点。该基因/蛋白达到的技术指标为1、 hURATl基因中我们共发现了 13个SNP位点，其中12个与已知报道相符，但我们发现的 第3内含子+11G>A位点在国内、国际上均未见有相关报道，因此，该位点是hURATl基 因的一个新的SNP位点(测序图见图l)。2、 13个SNPs Hardy-Weinberg平衡检验显示所有实验样本均符合随机性原则(见表l)。3、 SNPs等位基因及基因型频率进行比较结果显示，高尿酸血症患者中第三内含子+llG〉ASNP, A等位基因频率为6.28。/。，在正常对照者中仅为1.7%，差异具有极显著性(A5.94X10—5)。 高尿酸血症患者AG+AA突变基因型频率显著高于正常对照组(12.11% VS 3.40%， /^8. 21 X10—5 )(见表2)。4、 单倍型Ht4 (包含所有突变型等位基因)在高尿酸血症组中的频率显著高于正常对照组， 与原发性高尿酸血症发病危险性密切相关(5.73% VS 1.74%,尸=5.93X10,。单倍型Ht4是4种单倍型中唯一包含第三内含子+3， 11 G〉A SNP A突变型等位基因的单倍型，并 是唯一与高尿酸血症密切相关的单倍型93X10—5)(见表3)。5、 连锁分析结果显示，第三内含子+3， 11G〉A不位于任何一个周围高度连锁的hURATl基因 BLOCK中，在基因连锁图中呈现断开现象(见图2)。6、 对发现的13个hURATl基因SNP位点进行Logistic回归分析结果显示，如果固定SNP11(+3， 11G〉A)，其它任何SNP位点都不能改变它的尸值，相反SNPll (+3， 11G〉A)可以 改变其它任何一个SNP位点的尸值(见表4)。附图说明图1. hURATl基因第三内含子+3， 11G>A三种基因型GG， GA， M 图2. hURATl基因SNP位点连锁分析结果1-13代表hURATl基因上13个SNP位点l(SNPl): Promotor， -454A/T; 2(SNP2): Promotor， -434T/C ; 3(SNP3): Promotor, —382C/T; 4(SNP4): Promotor, -87C/T; 5(SNP5): Promotor, +118G/A;6(SNP6): Exon 1,C258T; 7(SNP7): Exon 2，C426T; 8(SNP8): Intron2， +271A/G ;9(SNP9): Intron 2， +277 C/T; 10(SNP10) : Intron 2，十278A/G; 11 (SNP11): Intron 3,+11 G/A; 12(SNP12): Intro 8，-103G/A; 13(SNP13): Exon8, T1309C.具体实施方式-1、 研究对象的分组与收集(1) 原发性高尿酸血症组收入标准普通饮食并排除心、肝、肾以及全身性疾病的基础上，连续三次测定男性及绝经后女性血清中尿酸含量超过416umol/L，绝经前女性超过357 umol/L。 227例原发性高尿酸血症患者来自青岛大学附属医院内分泌门诊、内分泌病房及健 康体检中心。其中，男性193例，平均年龄49.58±14.33岁；女性34例，平均年龄54.2± 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术涉及维持血尿酸水平的关键基因－ｈＵＲＡＴ１，发现该基因第三内含子的ＳＮＰ位点＋１１Ｇ＞Ａ，其特征在于：首次在中国汉族人群中发现。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李长贵，苗志敏，闫胜利，韩琳，王云龙，孟冬梅，
申请(专利权)人：李长贵，苗志敏，闫胜利，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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