马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法技术

本发明专利技术属马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法，本发明专利技术是利用Ｔａｑ酶在ＰＣＲ扩增体系内将类病毒ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，同时完成ｃＤＮＡ扩增，用琼脂糖电泳检测扩增产物，判断病毒的有无。本发明专利技术检测速度快，可同时检测数十个样品；灵敏度高，可检测到纳克级的病毒ＲＮＡ；特异性强，由于引物的特异性，只能特异性地扩增病毒ｃＤＮＡ；廉价，Ｔａｑ的价格远远低于反转录酶。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于。马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)没有蛋白质外壳<瞿峰，田波病毒学报，9288，1993>，它的检测，不能用检测一般病毒的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法<郑光宇，Wichai等病毒学报，4150，1988>。目前普遍采用往复电泳(Return-PAGE)方法检测<陈炜，田波微生物通报，1(3)132，1985>，其灵敏度和简便性都略显不足。多聚酶链反应(PCR)技术在病毒检测方面具有廉价、快速、灵敏、特异性强等优点<陈枝楠等植物病理学报，27(3)198，1997>。PSTVd是一种RNA病毒，RNA不能直接通过PCR扩增，首先要反转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增<A.M.Shamloul，et al.Canadian Journal of Plant Pathology，1997，1989-96>。用传统方法检测，全部过程由两部分构成在反转录酶催化下，将RNA反转录为cDNA，再在Taq聚合酶催化下完成cDNA的扩增，通过检测cDNA，判断PSTVd的存在<何小源等中国病毒学，7362，1992，何小源，周广和病毒学报，8337，1992>。既使如此，两步法在PSTVd的检测中也尚未得到应用。马铃薯生产是我国仅次于小麦、水稻和玉米的第四大作物。由于马铃薯的优良品质，今后在我国还会有更大的发展。脱毒种薯是马铃薯生产的重要环节，其中PSTVd的检测是检验马铃薯脱毒效果的重要指标。目前的检测方法已不能满足未来生产的需要，迫切需要快速、灵敏的方法取代现有技术。本专利技术目的是提供一种，本专利技术是利用Taq酶在PCR扩增体系内将类病毒RNA反转录为cDNA，同时完成cDNA扩增，用琼脂糖电泳检测扩增产物，判断病毒的有无，具有特异性强、灵敏度高(可检测纳克级PSTVd病毒)、耗时短(4-5hr)、价格低(3-5RMB/assay)等特点。本专利技术包括病毒RNA的提取、PCR引物的设计、应用Taq酶将病毒RNA反转录为cDNA同时完成PCR扩增和cDNA的检测。本专利技术具体步骤详细描述如下1、病毒RNA的提取a.组织破碎取染毒马铃薯组织(包括植株体及果实)，加RNA抽提缓冲液(Tris 0.1M，NaCl 0.1M，HCl 0.075M，EDTA 0.01M，pH7.0，3-5ml/每克马铃薯组织)，加入石英砂(0.01-0.05g/每克马铃薯组织)，在液氮中研磨碎；b.抽提蛋白用2倍体积水饱和酚和2倍体积氯仿∶异戊醇(49∶1)抽提，冰浴10-15min；10,000-15,000rpm，4℃，离心15-20min；吸取上清液；c.沉淀并收集病毒核酸用3倍体积冷无水乙醇和0.25倍体积NaAC(4M)，-20℃沉淀20-30min。10,000-15,000rpm，4℃，离心15-20min，弃掉上清液；重复此述步骤1次；d漂洗并溶解病毒核酸用乙醇溶液漂洗沉淀1-2次，气干乙醇，用ddH2O溶解。2、PCR引物设计根据GenBank上PSTVd的全序列，在计算机辅助下，利用通用软件Oligo和Primer，根据内稳定性、变性温度及错配情况设计出引物P1、P2；P15’-GAAACCTGGAGCGAACTG-3’，P25’-CGGTTCCAAGGGCTAAAC-3’。3、PCR扩增取第一步粗提马铃薯核酸液，引物P1(0.5Pmol/每微升反应体系)，P2(0.5Pmol/每微升反应体系)，10×缓冲溶液(100mM Tris-HCl，500mMKCl，0.8％Nonidet P40)，MgCl2(1.2-1.5mM)，dNTP mix(0.2mM)，Taq酶(0.25U/每微升反应体系)；在下述条件下进行PCR72℃ 6min 40sec→94℃ 1min，37℃ 2min，72℃ 1min，10-20个循环→72℃ 5min→94℃ 1min，59℃ 30sec，72℃ 1min，35-40个循环。4、检测产物在琼脂糖凝胶中进行电泳检测。本专利技术与传统的RT-PCR反应相比，该方法具有特异性强(只能特异性地扩增病毒cDNA)、灵敏度高(可检测纳克级PSTVd病毒)、耗时短(检测速度快，可同时检测数十个样品，4-5hr)、价格低(3-5RMB/assay，Taq的价格远远低于反转录酶)等特点。本专利技术突出的实质性特点和显著效果可以从下述的实施例得以体现，但它们不是对本专利技术作任何限制。实施例取新鲜染毒马铃薯叶子(津引薯9号)1g，加RNA抽提缓冲液5ml，加入少许石英砂，在液氮中研磨成粉状。用2倍体积水饱和酚和2倍体积氯仿∶异戊醇(49∶1)抽提，冰浴15min。10,000rpm，4℃，离心20min，吸取上清液。用3倍体积冷无水乙醇和0.25倍体积NaAC(4M)，-20℃沉淀30min。12,000rpm，4℃，离心20min。重复上述步骤1次。用70％乙醇漂洗2次。气干乙醇，用适量ddH2O溶解。PCR引物设计根据GenBank上PSTVd的全序列，在计算机辅助下设计出引物P1、P2P15’-GAAACCTGGAGCGAACTG-3’，P25’-CGGTTCCAAGGGCTAAAC-3’。PCR扩增(反应体系20μl)取粗提马铃薯核酸液1μl，引物P1 10Pmol，P2 10Pmol，10×Buffer 2μl，MgCl2(25mM)1.6μl，dNTP mix(10mM)0.4μl，Taq酶5U，ddH2O11.75μl；如下条件做PCR72℃ 6min 40sec→94℃ 1min，37℃ 2min，72℃ 1min，10个循环→72℃ 5min→94℃ 1min，59℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环。检测产物在2％Agrose中进行电泳检测，见图一。图中第一条泳道显示的是分子量marker，第二条泳道显示的是用本方法扩增出来的PSTVd的产物。通过与正对照和负对照比较，判断有病毒PSTVd。对比实施例一通过比较传统的RT-PCR和本技术的电泳照片可以发现，一步法RT-PCR扩增产物的大小与传统的RT-PCR扩增产物是一致的，且电泳带的亮度相近。对比实施例二利用PSTVd序列中HaeIII的单酶切位点酶切和嵌套式PCR验证，均表明一步法RT-PCR所检测到的正是PSTVd病毒。此结果见图二，其中第一条泳道显示的是分子量marker，第二条泳道显示的是用本方法扩增出来的PSTVd的产物，第三条泳道显示的是嵌套式PCR反应结果，第四条泳道显示的是嵌套式PCR产物酶切反应结果。另外，用RNase(无DNase)处理过的染毒马铃薯RNA样品做RT-PCR，所得到的结果呈阴性。表明本方法扩增得到的产物是来自病毒RNA，而不是马铃薯DNA。权利要求1.一种，其特征在于它包括如下步骤(1)、取染毒马铃薯组织，加入3-5ml/每克马铃薯组织，含有Tris、NaCl、HCl和EDTA的pH7.0的RNA抽提缓冲液及石英砂，在液氮中磨碎；根据计量体积数，用2倍体积水饱和酚和2倍体积的氯仿∶异戊醇抽提，其中氯仿∶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法，其特征在于它包括如下步骤：（１）、取染毒马铃薯组织，加入３－５ｍｌ／每克马铃薯组织，含有Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ、ＨＣｌ和ＥＤＴＡ的ｐＨ７．０的ＲＮＡ抽提缓冲液及石英砂，在液氮中磨碎；根据计量体积数，用２倍 体积水饱和酚和２倍体积的氯仿∶异戊醇抽提，其中氯仿∶异戊醇的体积比为４９∶１，冰浴１０－１５ｍｉｎ；１０，０００－１５，０００ｒｐｍ，４℃，离心１５－２０ｍｉｎ，吸取上清液；用３倍体积冷无水乙醇和０．２５倍体积４Ｍ的ＮａＡＣ，－２０℃下沉淀２０－３０ｍｉｎ，１０，０００－１５，０００ｒｐｍ，４℃，离心１５－２０ｍｉｎ，弃掉上清液，重复此步骤１次；用乙醇溶液漂洗沉淀１－２次；气干乙醇，用水溶解，得到病毒ＲＮＡ的提取液；（２）、根据ＧｅｎＢａｎｋ上ＰＳＴＶｄ的全序列，设计出Ｐ ＣＲ引物Ｐ１、Ｐ２；Ｐ１：５’－ＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＡＡＣＴＧ－３’，Ｐ２：５’－ＣＧＧＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＡＣ－３’；（３）、取第一步粗提马铃薯核酸液，引物Ｐ１ ０．５ Ｐｍｏｌ／每微升反应体系，Ｐ２ ０．５ Ｐｍｏｌ／每 微升反应体系，１０×缓冲溶液，其成份为：ｐＨ８．８的１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＫＣｌ、０．８％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０和１．２－１．５ｍＭ ＭｇＣｌ↓［２］；０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ，０．２５Ｕ／每微升反应体系Ｔａｑ酶；在下述条件下进行ＰＣＲ扩增：７２℃ ６ｍｉｎ ４０ｓｅｃ→９４℃ １ｍｉｎ，３７℃ ２ｍｉｎ，７２℃ １ｍｉｎ，１０－２０个循环→７２℃ ５ｍｉｎ→９４℃ １ｍｉｎ，５９℃ ３０ｓｅｃ，７２℃ １ｍｉｎ，３５－４０个循环。（４）、产物在琼 脂糖凝胶中进行电泳检测。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜荣骞，叶明，李德森，居玉玲，李戌彤，古瑜，罗智敏，魏众济，
申请(专利权)人：南开大学，天津科润农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]