VNTR等位基因的提取与利用制造技术

本发明专利技术描述的是提取ＶＮＴＲ等位基因的一种新方法，该方法还通过同时比较多个体的复合基因组，伴随检查多个基因座位上遗传性状的多态标记。所述产品被称为性状信息丰富的等位基因总代表（ＴＲＡＩＴ）。这些等位基因可直接被用做遗传标记或可被用做便于精确定位相关序列变化的载体。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利
是检测复杂基因组的多态变异，它是所有生物中遗传性状研究的主要内容。由于多基因性状的价值远比单基因性状重要，容许一齐分离多个个体复合基因组中数个信息丰富的多态性的方法可为遗传性状的研究提供极其有力的工具。本专利技术根本上不同于所有其他先前已使用的技术，其不同之处是(i)容许快速和容易的从DNA大量产生VNTRs(ii)产生既与一种性状连锁又是性状信息丰富的多态性；(iii)再生和保留多态性等位基因，就如同其在基因组中表现的那样；(iv)消除其他聚合酶链反应为基础的技术所特有的问题，包括引发丢失现象，反应污染和生成假产物；(v)不需要将研究限制到密切相关个体的家系；(vi)容许进行多基因性状分析；(vii)很少需要DNA起始物。因此本专利技术代表生物医学领域工作人员迅速而准确的筛选简单或复合基因组的与有利或有害单基因或多基因遗传性状共分离的多态性能力之较大提高。通过产生与社会或经济重要的遗传病或性状共分离的多态性标记，在改进医药，兽医，法医，农业，畜牧业和生物技术方面存在着巨大潜力。本专利技术还将用于便利所有相关生物的突变分析。引言DNA是一种由四种单核苷酸单位重复组成的一种双链线形聚合物。这些单位在其中排列产生遗传密码的序列被称为基因组。虽然一个物种内所有个体的基因组基本上是同源的，仍存在着影响个性的细微变异。可存在一个以上序列变异的基因组的位置被称为多态性，所述序列的每个变异体代表一个等位基因。形成配子的生发细胞中的多态性通过随后子代的增殖而遗传。通过研究一个个体的基因组中多态性组合，可指定一个独特的编码(‘指纹’)并可确定该个体的祖先。另外，被发现与一种具体遗传性状或遗传病连锁和共分离的一个多态性可被用做遗传筛选其他个体中该性状或疾病的一个标记。复合基因组中的有利或有害性状的研究由于其经济，医学与社会的应用，已成为密切关注的课题。建立能比较复合基因组中核酸序列和那些序列的子集所特有的差异之分离的方法是这个领域的研究的一种基本需要。在动物和植物中已使用许多方法比较核酸序列和那些序列在个体之间的差异之分离。这些方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)，随机扩增的多态DNA标记(RAPD)，扩增的片段长度多态性(AFLP)，代表性差异分析(RAD)，基因组错配扫描(GMS)，和可变数目的串联重复序列的连锁分析(VNTR)。这些方法通过检测一个基因组中总DNA序列变异的子集检测多态性。通过RFLP，AFLP和RDA检测的多态性取决于从凝胶电泳产生的指纹阶梯图，它反映出片段长度的变异。RAPD多态性产生于引物结合部位的序列变异和引物结合部位之间的长度差异。GMS多态性产生于包含两个相关个体衍生的限制性片段之杂合分子内的序列变异。连锁分析包括检测可变数目的串联重复序列(VNTRs)的长度变异和等位基因与目的性状的共分离。RFLPRFLP分析依赖于通过限制性内切核酸酶进行的核酸序列的切割和凝胶电泳所产生的片段的分离。所述片段被印迹在膜上并与标记的探针杂交以能够检测片段长度变异。这个技术在研究单分离的基因座位或基因片段方面可能是有用的，但在研究不限于一个分离的序列时，该技术就不够用。进一步的限制是只有少量所产生的多态性可能是信息丰富的，因此十分需要DNA起始物，并且这种方法工作量大。RAPDRAPD在基因组指纹法和各种研究中，特别对植物物种而言是一种常规使用的PCR为基础的多态标记技术。该技术包括使用单一‘任意引物’，所述引物引起基因组DNA序列(从5’到3’的方向)与所述任意引物之间有足够同源性的基因组区段的扩增。其扩增产物通过凝胶电泳进行分离。这种方法的细微修改方法包括任意引发的-PCR(AP-PCR)和DNA扩增指纹法(DAF)。然而，通过PCR进行的任意引发和DNA扩增的原理对所有方法而言是共同的。与RFLP比较的优点是，这些方法更快速，需要的DNA少，并且不需要序列的背景知识。与RFLP一样受到的限制是每种分析仅能比较两个个体的基因组。虽然数个基因座位可通过该方法同时评估，多态性检测需要通过凝胶电泳观察带型的变异并可发生类似电泳迁移率的不同等位基因的重叠错误。许多条带可能是微弱而难于把握，并且难于在重复实验中得到一致结果。与多数PCR技术一样，实验结果易于因反应条件的细微改变，试剂的污染和不一致的带型的产生而发生错误。这种可靠程度的缺乏限制了这种技术在个体‘分型鉴定’中的应用。AFLPAFLP分析(EP，A，0534858；Zabeau M等)包括DNA的限制性内切核酸酶的消化和所产生的限制性片段与衔接子的连接。使用与衔接子序列互补的引物，通过PCR扩增所述限制性片段，并通过凝胶电泳显示多态性的带型差异分离所述产物。微卫星-AFLP(WO96/22388；Kuiper M等)是所述技术的一种修改方法，其中用两种或两种以上的限制酶(其中至少一种在单一序列重复区切割)将DNA切成片段，以便与衔接子连接。所述片段用与所述衔接子序列互补的引物扩增。与RAPD相同，通过这种方法可同时评估数个基因座位，但检测多态性需要观察凝胶电泳的带型变异，而且会出现类似电泳迁移率的不同等位基因的重叠错误。在AFLP指纹图谱上记录条带的能力受到其中有些可能会十分微弱和难于辨认的大量条带产生的不良影响。而且，所述技术易于出综上所述所有PCR为基础的方法共有的错误。并且不能同时分析多个复合基因组。综合由于对模板DNA的不完全限制酶解所产生的带，则未反映出真实的多态性。因此AFLP和RAPD分析共有许多同样的限制。另一个问题是AFLPs不是均匀散布在所述基因组中，而是据报道在中心粒周围簇集。因此，若它们位置远离中心粒，则该方法可能不容许产生与目的序列差异共分离的多态性。这个问题反映在与如连锁分析等技术相比多态性检测率的降低。而且，通过AFLP取得的实验数据的复杂性随着被分析的基因组的复杂性的增加而加大。因此，尽管可能通过AFLP分析研究某些植物物种的基因组，高等真核生物物种的相对复杂的基因组可能超出了这个技术的应用性。RADRAD包括DNA的限制性内切核酸酶消化，所述片段与衔接子的连接和PCR扩增。被比较的基因组之间的差异通过扣除杂交法的连续循环和动力学富集进行筛选以便选出差异明显的区域。这种技术因受反应污染和假产物的产生而易于得到错误结果。此外RDA的基本需要是要有可利用的密切相关个体的家族，其中某些个体有明显的目的性状。在任何非密切相关或高度近亲婚配的基因组进行RDA的情况，对简洁而有用的分析而言差异的多重性太大。GMSGMS是对鉴别两个相关个体的祖籍身份的区域做图的技术。因为基因组样品没有被扩增，在对DNA要求高的单杂交中对完整基因组进行比较。无须事先的图谱资料，常规引物或凝胶电泳可能是其优点。然而，所述方法限于使用两个相关个体的基因组。将两个基因组的限制性片段进行杂交，其中之一已被甲基化以便杂交分子可通过其对Dpn I和Mbo I的抗性来鉴别，它们分别只切割完全甲基化的和未甲基化的分子。筛选含缺乏错配同源双链的异源杂交并用于探测一系列被做图的克隆。虽然在此技术中使用的错配蛋白质可分析点突变，却检测不出含超出该系统限制的更大量错配的多态性。因此，与RFLP，AFLP，RAPD，和RDA一致的是，GMS倾向于分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
制作目的物种的一个或多个成员的基因组ＤＮＡ之ＶＮＴＲ等位基因及其侧翼区的混合物的方法，所述方法包括步骤：（ａ）将目的物种的基因组ＤＮＡ分成片段，（ｂ）每个片段的每端连接一个衔接子，由此形成衔接子终止的片段混合物，其中每个３’端被封闭 以防止酶促链延伸反应，（ｃ）用部分衔接子终止的片段混合物作为模板，用一个衔接子引物和一个ＶＮＴＲ引物产生５’侧翼ＶＮＴＲ扩增引物的混合物，（ｄ）用部分衔接子终止的片段混合物作为模板，用一个衔接子引物和一个ＶＮＴＲ反义引物产生一个３’ 侧翼的ＶＮＴＲ扩增引物的混合物，（ｅ）以５’侧翼ＶＮＴＲ扩增引物的混合物和／或３’侧翼ＶＮＴＲ扩增引物的混合物作为引物，用目的物种的一个或多个成员的基因组ＤＮＡ作为模板制作所需要的ＶＮＴＲ等位基因及其侧翼区的混合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：格雷格弗思，
申请(专利权)人：格雷格弗思，
类型：发明
国别省市：GB[英国]