双链DNA和杂环低聚物之间复合物的形成制造技术

本发明专利技术提供了在双链ＤＮＡ和杂环、脂肪族氨基酸、特别是Ω氨基酸和极性末端基团的低聚物之间形成复合物的方法和组合物。通过适当选择靶序列和低聚物的组合物，得到具有低解离常数的复合物。该复合物的形成可被用于鉴定特定的双链ＤＮＡ序列，被用于抑制基因转录，并且作为治疗剂用于抑制不期望的细胞的增殖或不期望的基因的表达。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
根据国家健康研究院提供的资助No.GM26453，27681和47530，美国政府在本专利技术中享有一定的权利。相关申请本申请是1997年4月21日递交的申请号08/837,524的继续部分申请，后者是1996年2月26日递交的，1997年2月20日提交为PCT申请US97/03332，的申请号08/607,078，和1996年7月31日递交的临时申请60/023,309，1996年8月1日递交的60/024,374，1996年9月25日递交的60/026,713，和1997年2月14日递交的60/038,384的部分继续申请。背景随着核酸的合成，分析和操作技术的发展，已经产生了许多诊断和治疗的新技术。在研究工作中，对能够鉴定与特定的生物体，等位基因，突变体相关的DNA序列一直是人们关注的问题，以便理解特定的遗传过程，疾病鉴定，法医鉴定等。同样，对于许多应用来说，为了鉴定特定基因的功能，基因产物的细胞浓度的各种变化对细胞的功能或其它细胞特征的影响，人们希望能够调节特定基因的活性。在治疗中，人们希望能够抑制一些细胞的增殖，如细菌，真菌和衣原体细胞，这些细胞具有致病原的作用。人们也希望抑制病毒的增殖，哺乳动物的增殖，它们的增殖可导致对寄主或其它情况的不利影响。在体内，人们可以提供可逆的或不可逆的失效，从而可从胎儿的发育过程中，收集一个或多个基因产物的水平的降低对生物体的影响这类信息。在一些胚胎学文献中，Peter Dervan的研究小组已经证实氮杂环的低聚物可以用于结合双链DNA。已经证实，在G/C与N-甲基咪唑(Im)/N-甲基吡咯(Py)互补，C/G与Py/Im互补，A/T与T/A与Py/Py冗余性互补中存在特异性。事实上，N-甲基咪唑趋向于结合鸟苷，而N-甲基吡咯结合胞苷，腺苷和胸苷。提供两条链的杂环，作为1个或2个分子，与双链DNA形成2∶1复合物，而低聚物的两条链反平行，其中G/C具有并列的Im/Py，C/G对具有Py/Im，T/A对具有并列的Py/Py。杂环低聚物由酰胺氨甲酰基团连接，其中NH可以参与小沟中的腺苷和胸苷(附图说明图1)特别是腺苷中的氮和氧未配对电子的氢键。虽然这种复合物非常令人感兴趣，大部分的结合亲和力小于约106M-1。另外，靶DNA序列和参与错配的序列之间的区别常常不高于二倍。所以，对于许多目的，这些复合物的用途是有限的。环二聚体显示出亲和力得到改善，其中两个寡聚体在它们的末端通过γ-氨基丁酸相接，这时亲和力被增强至约109M-1。但是，在靶序列之间亲和力的不同对于三个不同的单碱基错配序列小于3倍。在存在大量天然的双链DNA时，这一低的序列选择性将严重地限制该化合物的应用。同样，对于许多应用，人们希望能够将该序列应用于活细胞。没有实验证明这些低聚物能够跨过细胞膜运输到核，并且在成功地运输到核中时，它们能够结合染色体DNA，其中染色体DNA以核小体存在。相关文献Wade等人，美国化学学会杂志，1992，114，8783-8794；Mrkish等人，美国科学院院刊，1992，89，7856-7590；Mrkish和Dervan，美国化学学会杂志，1993，115，2572-2576；Wade等人，生物化学，1993，32，11385-11389；Mrkish和Dervan，美国化学学会杂志115，9892-9899；Dwyer等人，美国化学学会杂志，1993，115，9900-9906；Mrkish和Dervan，美国化学学会杂志，1994，116，3663-3664；Mrkish等人，美国化学学会杂志，1994，116，7983-7988；Mrkish和Dervan美国化学学会杂志，1995，117-3325-3332；Cho等人，美国科学院院刊，1995，117，3325-3332；Cho等人，美国科学院院刊，1995，92，10389-10392；Geierstanger，自然结构生物学，1996，3，321-324；Parks等人，美国化学学会杂志，1996，118，6147-6152；Parks等人，美国化学学会杂志，1996，118，6153-6159；Baird和Devan，美国化学学会杂志，1996，118，6141-6146；Swalley等人，美国化学学会杂志，1996，118-8198-8206；Trauger等人，美国化学学会杂志，1996，118，6160-6166；Szewczyk等人，美国化学学会杂志，1996，118，6778-6779；Trauger等人，化学和生物，1996，3，369-377；Trauger等人，自然，1996，382，559-561；Kelly等人，美国科学院院刊，1996，93，6981-6985；Szewczyk等人，ANGEW.CHEM.INT.ED.ENGL.，1996，35，1487-1489；Pilch等人，美国科学院院刊，1996，93，8306-8311；White等人，生物化学，1996，35，12532-12537。专利技术概要本专利技术提供了用于在双链DNA和有机环基团的低聚物之间在小于等于1纳摩尔的浓度下选择性生成复合物的方法和组合物，其中至少60％的环基团是杂环，至少60％的杂环至少具有一个氮环成员。杂环形成互补对，其中至少两个核苷酸对优先地与特定的杂环对配对。作为单个低聚物的发夹回转，或两个低聚物分子的有机环基团之间的互补的结果，在复合物中至少存在三个有机环基团的互补对。通常，一种小脂肪族氨基酸将分散于或分开6个或更多个连续的有机环基团的链。为了进一步增强结合，一个末端可以具有至少一个2到6个碳原子的脂肪族氨基酸和/或一个具有靠近烷基链的键的极性基团的烷基链。通过适当选择靶序列、互补对、未配对的有机环基团、脂肪族氨基酸、和极性取代的烷基链，可形成高亲和性、低解离常数、和在靶序列和单碱基错配之间的亲和性显著不同的复合物。将低聚物进行修饰，以提供特异的特性并且允许存在于没有明显干扰低聚物在小沟中的定位的位点。发现该组合物能够进入活细胞并且抑制包括靶序列的基因的转录，在特定的位点裂解，在特异的位点变成共价结合，指导选择的分子到靶位点以及进行其它需要的活动。在复合物形成条件下该低聚物可以与双链DNA结合形成复合物。该复合物的形成可以用于诊断，以便检测特定的双链DNA序列，其中可使用可检测标记对该低聚物进行标记，以便在体外或体内的细胞组织学检测中可逆地或不可逆地“失效”基因，从而抑制原核细胞或真核细胞等的细胞的增殖。附图的简要说明图1(a)识别DNA小沟的模型。DNA双螺旋由A，T和G，C碱基对组成，好像在旋转的梯上的横档。通过在碱基对边缘上展示的氢键供体和受体的类型可以区别个别序列。A，T碱基对在小沟中提供两个对称放置的氢键受体，由环内的点表示的嘌呤N3和嘧啶O2。G，C碱基对提供这两个受体，但另外还提供一个氢键供体，由含有H的环表示的鸟苷的2-氨基基团。因为氢键载体靠近含鸟苷的链，GC和CG碱基对可以在小沟中区别。(b) 在DNA小沟中侧对侧复合物Py/Im聚酰胺的吡咯-咪唑识别DNA的配对规律，DNA结合序列特异性依赖于侧对侧的氨基酸对的序列。Im对Py的配对靶击GC碱基对，而Py对Im配对靶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在靶双链ＤＮＡ和１到２个低聚物在小沟中的位点形成特异的复合物的方法，其中对所述的低聚物进行选择以提供Ｋ↓［ａ］为至少１０↑［９］Ｍ↑［－１］的与所述的靶双链ＤＮＡ的结合，所述的低聚物含有作为核心结构的：（１）５到６个环成员的有机环基 团，其中至少６０％的环是具有１到３个杂原子的杂环，其中杂原子是氮，氧和硫，并且其中至少６０％的杂环至少具有一个氮原子，其中所述的低聚物被限定为具有至少６个所述的含有氮的杂环，其中所述的杂环中的至少一个是特异于Ａ，Ｇ，Ｃ或Ｔ的，并且杂环的互补对参照核苷酸的互补对，所述的低聚物含有至少两个与作为第一低聚物的自身或与作为第二低聚物的另一个低聚物形成互补对的两个连续的杂环的单元，其中当所述的低聚物与它自身形成所述的互补对时，所述的低聚物含有形成发夹回转的内部分子，并且当两个低 聚物形成所述的互补对时，所述的两个低聚物含有一种２到６个碳原子的内部脂肪族氨基酸，其中所述的内部脂肪族氨基酸优先与Ａ和Ｔ并列，并且与它自身形成互补对，和有机环基团末尾上的至少一个末端：（２）２到６个碳原子的脂肪族氨基酸；和（３）含有一个 极性基团的烷基链，该极性基团从连接所说的烷基链和低聚物的其余部分的键具有２至４个碳原子，所述的杂环通过２个碳原子的链连接，该链含有ＮＨ基团，以便与所述双链ＤＮＡ的可以得到的氮和氧原子形成氢键，先决条件是远离所述的小沟的表面的氢原子可以利用总数不超过１００个碳原子的取代基取代，所述的方法包括：在复合物形成条件下将所述的低聚物与双链ＤＮＡ放置在一起，从而在所述的第一个和第二个低聚物之间在靶双链ＤＮＡ处形成复合物。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：皮特德万，
申请(专利权)人：加利福尼亚州技术学院，
类型：发明
国别省市：US[美国]