一种新的人凝血栓蛋白-1介导因子及其应用和制备方法技术

本发明专利技术公开了人凝血栓蛋白－１介导因子和编码此多肽的ＤＮＡ（ＲＮＡ）以及通过重组技术生产此多肽的方法。本发明专利技术还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法，如获得性和遗传性的免疫缺陷、退行性神经疾病、脊髓发育不良疾病、局部贫血性伤害、骨硬化病等。本发明专利技术还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明专利技术还公开了编码该人凝血栓蛋白－１介导因子的多核苷酸的用途。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及新的编码人凝血栓蛋白-1介导因子的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本专利技术还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。凝血栓蛋白-1介导因子(Muskelin)是一种新发现的、广泛表达的胞内凝血栓蛋白-1调节蛋白，它促使凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1)附着于细胞骨架并且是细胞黏附的中介体。(EMBO J 1998，Sep 1；17(17)；4976-74)凝血栓蛋白-1(TSP-1)是一种由血小板a-粒子释放的对凝血酶有刺激作用的糖蛋白，也是生长和修复所需的胞外基质的成分之一，它的三聚体分子量为420kDa。有很多因子都对TSP-1的表达起调节作用，其蛋白通过胞外和胞内两种途径降解(Int J Biochem Cell Biol1997 Jun；29(6)861-5)。研究结果显示，人黑素瘤细胞G361能在含有TSP-1的基质中迅速附着和扩散，然而，当TSP-1肝磷脂结合位被硫酸化、或与A2.5单克隆抗体结合，可选择性的抑制细胞扩散而不会影响附着功能；当单克隆抗体结合在凝血栓蛋白-1的其它功能域上，则可有力地抑制其附着功能。(Cancer Metastasis Rev 1992 Nov；11(3-4)313-24)凝血栓蛋白-1调节因子(Muskelin)主要存在于细胞质中，或附着于细胞膜上，对果蝇的kelch ORF1蛋白和C2C12细胞的研究表明，其功能是刺激细胞附着于TSP-1的C’端，TPS-1调节因子缺失会造成含有TSP-1附着剂的细胞在细胞的黏附、扩散和细胞骨架组织方面的活性降低。凝血栓蛋白-1介导因子是通过其在细胞内对分子的粘附而对细胞的移动、细胞增殖、神经突的生长及血管生成起调节作用。对这些活性的潜在分子机制的研究已经表明，凝血栓蛋白-1在医学上可用于止血法和血管生成。因此，为治疗目的研究和开发人凝血栓蛋白-1介导因子及其激动剂/抑制剂有重要意义。本专利技术的一个目的是提供新的分离的人凝血栓蛋白-1介导因子多肽。本专利技术的多肽鉴定为人凝血栓蛋白-1介导因子是经过氨基酸同源比较得出的。本专利技术的另一个目的是提供编码人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的DNA序列。本专利技术的另一个目的是提供编码人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的重组表达载体。本专利技术的另一个目的是提供含有编码人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的重组表达载体的宿主细胞。本专利技术的另一个目的是提供生产编码人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的方法。本专利技术的另一个目的是提供针对本专利技术的人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的抗体和拮抗剂。本专利技术的另一个目的是提供诊断治疗与人凝血栓蛋白-1介导因子多肽功能异常相关的疾病的方法。例如本专利技术多肽或多核苷酸可用于肿瘤、脊髓发育不良、骨硬化等相关疾病的治疗。本专利技术的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。在本专利技术的一个实施方案中，本专利技术提供了一种分离的或基本上纯的人凝血栓蛋白-1介导因子多肽，其基本上由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成。本专利技术的多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的。它包含的多核苷酸序列全长为3011个碱基，其开放读框为SEQ ID NO1中24-2231位，编码735个氨基酸的人凝血栓蛋白-1介导因子。根据氨基酸序列同源比较发现，此多肽与灰鼠凝血栓蛋白-1介导因子之间也有高度同源性，因此被确定为是人的凝血栓蛋白-1介导因子。术语“分离的”是指材料从其原始环境中被提取。例如，在一个活的动物体内存在的多核苷酸不是分离的，而从天然系统中的一部分或所有共存材料中分离出来的同样的多核苷酸就是分离的。这样的多核苷酸可以是载体或某组合物的一部分，只要这些载体或组合物不是其天然环境的一部分，则多核苷酸仍然是分离的。本专利技术的多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的。它在结构上具有凝血栓蛋白-1介导因子的特征，同时，此蛋白和灰鼠凝血栓蛋白-1介导因子之间也有高度同源性，在整个氨基酸序列的735个蛋白中有728个蛋白相同，即有99％同源性。本专利技术中的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，其中的DNA可以是cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链的或单链的，如果是单链的则可以是编码链或是非编码链(反义链)。编码此成熟多肽的多核苷酸序列可以和SEQ ID NO1所示的核酸序列相同，或者可以是编码与SEQ ID NO2所示蛋白相同的成熟多肽，但与SEQ ID NO1所示核酸序列不同的多核苷酸。本专利技术中的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本专利技术还涉及上面描述的多核苷酸变异体，其编码与本专利技术有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。由上可见，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本专利技术的多核苷酸还可以是包括前导序列的多核苷酸；编码一个有成熟蛋白和附加的氨基酸残基的多肽(蛋白原)的多核苷酸。这样，本专利技术的多核苷酸可以编码成熟蛋白，或有序列原的蛋白，或同时具有序列原和前导序列的蛋白。本专利技术还涉及这样的多核苷酸，即当其与本专利技术所描述的多核苷酸序列有50％～70％相同的序列时可与之杂交。本专利技术特别涉及在严格条件下与本专利技术所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。术语“严格条件”“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。根据本专利技术的又一个方面，提供的人凝血栓蛋白-1介导因子应包括如SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽和这种多肽的片段、类似物和衍生物。术语‘片段’、‘衍生物’和‘类似物’是指与本专利技术所述的多肽有相同的生物学功能或活性的多肽。这样，类似物也包括了切除蛋白原部分能被激活产生活性成熟多肽的蛋白原。本专利技术中的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选是重组多肽。本专利技术的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主细胞(例如，细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据所用的宿主细胞的不同，本专利技术的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本专利技术的多肽还可包括一个起始的甲硫氨酸残基。本专利技术中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均一。本专利技术还涉及包含本专利技术的多核苷酸的载体，和含有本专利技术所述的多核苷酸的遗传工程宿主细胞和用重组技术生产本专利技术所述的多肽的方法。本专利技术中可用于包含多核苷酸序列的载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，比如，细菌质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的人凝血栓蛋白－１介导因子多肽，它包含：具有ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛裕民，谢毅，
申请(专利权)人：上海生元基因开发有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]