与肝癌标志物GPC3相关的亲和肽制造技术

本发明专利技术属于生物工程制药技术领域和蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，具体涉及针对肝癌特异性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican‑3，GPC3)具有高亲和力的多肽，本发明专利技术多肽能高效而特异性地结合GPC3，通过标记示踪的荧光物质所形成的多肽探针，在体内和体外实验中均能高效靶向HCC肝癌细胞，显示了良好的肿瘤靶向性和HCC检测应用前景。

Affinity peptide associated with liver cancer marker GPC3

The invention belongs to the field of biotechnology and pharmaceutical protein and peptide drugs and biomedical engineering, particularly for hepatoma specific glypican 3 (glypican 3, GPC3) with high affinity peptides, polypeptides of the invention can efficiently and specifically bind with GPC3 peptide probe formed by fluorescent substance tracing the in vivo and in vitro were highly targeted HCC cells showed a good application prospect of tumor targeting and HCC detection.

【技术实现步骤摘要】
与肝癌标志物GPC3相关的亲和肽
本专利技术属于生物工程制药
和蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，具体涉及针对肝癌特异性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)具有高亲和力的多肽及其应用，例如用于肝癌的特异性诊断和治疗。
技术介绍
当前在中国，癌症已超过其他病因成为疾病死因之首，发病率和死亡率还在逐年攀升之中，因此癌症已成为非常重要的公共健康问题。其中，肺癌、胃癌、食管癌和肝癌是我国发病率和死亡率较高的常见肿瘤，且在60岁以下男性中，肝癌是最常见和死亡率最高的癌症。肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是肝癌的主要类型，尽管手术和放化疗等方法可以缓解患者症状、延长生存时期，但HCC患者5年存活率仍低至15％。由于现有肝癌诊断缺乏灵敏有效的方法，当肿瘤确诊时一般已发展为晚期，因此如何提高诊断的灵敏度和特异度、开发早期筛查和早期诊断的新方法将有助于提高肝癌的诊疗水平。现有研究表明，GPC3可作为检出早期肝癌的理想分子标志物，具备良好的临床应用价值。GPC3是硫酸乙酰肝素(HeparanSulphate，HS)蛋白聚糖家族的一员，是一种细胞外跨膜糖蛋白，可通过糖基磷脂酰肌醇锚定附着在细胞表面。GPC3高表达于胚胎和胎儿期肝脏，而在正常成人肝细胞和其他器官组织中均不表达，此外约有75％的肝癌组织、尤其是HCC组织中GPC3mRNA呈高水平表达，而肝母细胞瘤、肝腺瘤、胆管癌及肝转移性瘤不表达或极低水平表达。由于GPC3易受细胞的蛋白转换酶水解作用形成游离sGPC3进入循环系统，因此在HCC临床诊断方面，GPC3可与AFP联用诊断来协助确认肝癌病变，能显著提高诊断的准确性。当患者血清中GPC3出现降低或消失，表明预后良好，而GPC3出现高表达可能是癌症复发或转移的潜在标志。病理学诊断方面，GPC3可作为一种新的肿瘤标志物应用于肝癌的临床病理免疫组化诊断与鉴别诊断，用于疾病诊断和预后评估。除了作为诊断的靶点，由于其特有的生理功能，GPC3还能作为HCC分子靶向治疗的作用靶点，例如，靶向GPC3的CART细胞，能够有效地消除GPC3阳性的HCC细胞，从而为治疗肝癌提供了一种很有前景的免疫治疗新方法。在肝癌的活体诊断方面，靶向GPC3的活体成像检测探针能够无损实时在位地检测GPC3阳性的HCC，能够区分正常组织和恶性病变部位。例如已有报道，用89Zr偶联抗人GPC3mAb所形成的探针(89Zr-DFO-1G12)能够成功地检测到高表达GPC3的HepG2肿瘤。有研究也采用GPC3抗体的(Fab’)2片段作为GPC3的靶向单元，可高度亲和GPC3阳性的细胞。虽然抗体具有突出的靶向能力和特异性，但其尺寸和分子质量导致其肿瘤渗透不深、免疫原性强、代谢缓慢，不利于体内代谢和活体靶向、存在交叉反应并且难以制备。相反，小分子多肽所介导的分子影像探针具有靶向性高、易制备、低免疫原性、稳定性好和易传送等优势，鉴于这些优势，开发出理想的多肽分子探针对HCC的诊断和治疗具有重大的意义。目前公开的关于肝癌靶向多肽分子相关的研究主要是针对单一肝癌细胞，并主要采用噬菌体随机肽库体内展示技术进行筛选。该筛选方法主要针对肝细胞肝癌细胞系或肝癌裸鼠模型进行筛选，如CN201110451767.2公开的是特异性结合肝癌细胞系HepG2的多肽，以及CN1224630C公开的肝肿瘤靶向多肽。然而，这些多肽大多不是肝癌特异性标志物相关的靶向多肽，而且其功能仅仅停留在细胞和动物水平上的有效性。由于这些多肽不具有靶点特异性，因而在实际临床应用中在体内对肝癌的结合能力和靶向特异性可能会出现较大的偏差，如产生脱靶效应。目前，针对肝癌特异性标志物GPC3设计高亲和力和高靶向性的多肽分子探针鲜有报道。我们注意到，有文献报道了通过噬菌体展示库筛选出了GPC3靶向多肽，其序列为：DHLASLWWGTEL(在这里我们将其命名为YP)，并通过细胞实验和动物实验证明了其靶向性，但该多肽对GPC3的亲和力还是有限。
技术实现思路
本专利技术公开了能高度亲和GPC3的多肽，通过不同层面的比较，其所展现出的GPC3靶向性要显著优于文献所报道的多肽YP。本专利技术所述多肽能高效而特异性地结合GPC3，通过标记示踪的荧光物质所形成的多肽探针，在体内和体外实验中均能高效靶向HCC肝癌细胞，显示了良好的肿瘤靶向性和HCC检测应用前景。本专利技术多肽为制备肝癌早期诊断试剂、肝癌治疗药物和肿瘤靶向制剂等方面提供了新的途径。本专利技术多肽氨基酸序列如SEQIDNo:1(简称YGQ-1)或SEQIDNo:2(简称YGQ-2)所示。所述多肽为十多个氨基酸长度的短肽，分子量小，合成成本低廉。所述多肽特异性结合于肝癌组织但不限于肝癌组织，如还可能特异性结合于其他GPC3表达的乳腺癌等肿瘤组织。本专利技术公开了肿瘤特异性靶向多肽在制备肽类肿瘤早期诊断的用途，特别是作为肿瘤靶向分子影像探针和检测试剂盒方面的应用。本专利技术公开了肿瘤特异性靶向多肽在制备肿瘤治疗药物和肿瘤靶向制剂方面的用途，包括多肽偶联抗肿瘤药物、靶向纳米制剂等方面的应用。进一步地，本专利技术公开了一种绿色荧光探针，将本专利技术多肽与荧光染料异硫氰酸荧光素(英文简称FITC)偶联后形成探针，与细胞共孵育以检测荧光标记的多肽对GPC3的靶向作用，结果显示荧光标记的多肽结合GPC3后定位于细胞膜上，具有良好的靶向性。进一步地，本专利技术还公开了一种近红外荧光探针，将多肽与近红外染料ICG-Der-02(MPA)偶联后形成探针，注射于荷瘤鼠体内以检测其对肿瘤的体内靶向性和代谢分布，结果显示荧光标记的多肽对GPC3阳性的肝癌皮下移植瘤展现出了良好的示踪能力，具有良好的靶向性。本专利技术公开了一种用于肝癌检测的靶向探针诊断试剂盒，试剂盒中至少包括本专利技术多肽偶联的探针、封闭液、洗涤液等，具有出色的特异性和灵敏度。本专利技术的多肽与现有技术相比，所具有的有益效果在于：本专利技术所述的靶向多肽是由GPC3抗体可变区优化得到，具有分子量小、免疫原性小、生物毒性低、靶向性高、容易达到肿瘤组织等特点，且与YP相比，具有更优的肿瘤靶向作用。将本专利技术多肽应用于肿瘤的早期诊断和治疗，具有十分重要的临床意义。下面详细描述本专利技术的功效：一、体外细胞亲和力实验分别将人肝癌细胞HepG2、人脑胶质瘤U87细胞和人正常肝细胞L-02培养于六孔板中。待细胞生长到对数期时，分别与FITC标记的荧光多肽YP-FITC、YGQ-1-FITC、YGQ-2-FITC(均为1μM)共孵育4h，并通过流式细胞术检测其平均荧光强度。当多肽探针与细胞上的受体亲和力强时，流式细胞仪检测出的细胞平均荧光强度值高。图1是多肽探针YGQ-1-FITC和YGQ-2-FITC对不同细胞系HepG2、U87和L-02的亲和能力，并与YP-FITC进行比较。柱状图代表流式结果的定量分析。由图1可见，与GPC3高表达的HepG2细胞孵育后，YP-FITC、YGQ-1-FITC和YGQ-2-FITC其平均荧光强度分别为30、60和115，表明本专利技术的YGQ-1和YGQ-2对GPC3的亲和特性比YP-FITC更强，且YGQ-2更优。同时，在GPC3低表达或无表达的细胞系U87和L-02中，多肽探针平均荧光强度都很低本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤特异性靶向多肽，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤特异性靶向多肽，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNo:1或SEQIDNo:2所示。2.权利要求1的肿瘤特异性靶向多肽用于制备肿瘤诊断试剂的用途。3.权利要求1的肿瘤特异性靶向多肽用于制备肿瘤靶向药物的用途。4.一种肿瘤特异性靶向的多肽探针，包括权利要求1的多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾月清，张奇，韩智豪，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32