氯喹在促进脊髓损伤修复中的应用制造技术

本发明专利技术提供氯喹在促进脊髓损伤修复中的应用，其中氯喹抑制泛素化蛋白I‑kBα降解，从而通过抑制自噬调控的炎症促进脊髓损伤修复。其中泛素化蛋白I‑kBα可以在p62介导的自噬调控炎症LC3‑II‑p62‑I‑kBα反应机制调控下降解，进一步地引入氯喹，以干预泛素化蛋白I‑kBα的降解。

The application of chloroquine in promoting the repair of spinal cord injury

The present invention provides chloroquine in promoting the application of repair of spinal cord injury, including chloroquine inhibited ubiquitin protein I kB alpha degradation, so as to promote the repair of spinal cord injury by inhibiting autophagy regulation of inflammation. The ubiquitin protein I kB alpha kB alpha I can control the reaction mechanism in LC3 II autophagy regulates inflammation p62 mediated p62 degradation, further introduction of chloroquine to degradation of ubiquitinated protein I intervention kB alpha.

【技术实现步骤摘要】
氯喹在促进脊髓损伤修复中的应用
本专利技术涉及医药组合物领域，特别涉及氯喹通过对细胞自噬及炎症反应的调控达到促进脊髓损伤修复及抑制炎症反应的应用。
技术介绍
脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)是一种严重的神经系统性创伤，随着脊髓损伤发生率的急剧增加，给患者乃至整个社会带来了沉重的负担。令人沮丧的是，虽经百余年来全世界神经科学研究者的孜孜努力，脊髓损伤的治疗效果仍不尽人意，究其原因，主要是由于损伤脊髓的再生能力极其有限，影响脊髓损伤的因素多样，环境复杂。目前研究认为脊髓损伤包括两种机制，即原发性损伤和继发性损伤。其中原发性损伤为受伤瞬间，有外力或骨折脱位造成的损伤，是不可逆的。继发性损伤是指急性损伤后发生的一系列病理生理性改变，包括受伤局部发生的血管破裂、痉挛、组织缺血、缺氧、炎症等，最终导致包括凋亡和坏死在内的细胞死亡过程，其中在原发性损伤基础上进一步发生的继发性损伤才是影响脊髓功能恢复的重要因素。因此针对促进损伤脊髓组织的修复和功能重建方面的研发将具有重要的现实意义。细胞自噬是由溶酶体介导的降解细胞内蛋白质或细胞器的代谢过程,自噬激活的主要特征表现为由双层膜结构包裹的自噬体或空泡的大量堆积。细胞自噬已被证实与衰老、免疫和细胞死亡有关，并且在神经退行性疾病和恶性肿瘤的发病过程中也具有重要意义。值得注意的是，近期的研究表明脊髓损伤过程与细胞自噬密切相关。在受压迫性损伤的脊髓组织中，自噬标志蛋白LC3显着增加；在脊髓损伤的继发性损伤相关的炎症、缺血、缺氧等情况下，都有细胞自噬的激活。Kanno等研究表明在脊髓损伤模型中，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等有自噬性细胞死亡的发生,脊髓损伤后神经细胞的过度死亡将显着影响神经系统功能的修复和重建。自噬在不同疾病中的具体机制和作用存在着显着的差异，目前仍不明确。自噬一方面能够减少异常蛋白、陈旧细胞器的堆积，借此维持代谢及内环境稳定。然而过度的刺激，自噬的持续存在将导致细胞无法重新利用代谢产物来合成新的营养物质，从而出现细胞死亡(即II型细胞程序性死亡)。同样，细胞自噬在脊髓损伤中也扮演着重要的角色，深入探讨自噬在脊髓损伤血-脊髓屏障恢复中的作用必然具有着决定性的意义。同时脊髓损伤后炎症反应的发生及扩散也已被发现是脊髓损伤后继发性损伤的中心环节之一。在继发性损伤早期，存在重要的炎症反应过程，它能够促发一系列针对受损脊髓的细胞和分子水平反应；并且炎症反应可以导致受损脊髓局部胶质细胞疤痕的形成，也可能阻碍脊髓的再生。而炎性物质的释放及转运则促使脊髓暴露于炎症细胞及介质的毒性作用下，进一步诱发和加重继发性脊髓损伤，形成恶性循环。脊髓损伤后血管周围基底膜结构改变可促进炎症因子进入脊髓实质，进而诱导炎症反应扩大，还有如跨毛细血管内皮小泡运输增加，细胞间紧密连接变宽等。因此针对脊髓损伤后的炎症反应是脊髓损伤后继发性损伤的重要中心环节之一。细胞自噬的分子机制十分复杂，涉及到多种细胞内蛋白和复合物的调控以及线粒体、溶酶体、内质网等多个细胞器功能的改变，至今尚未被完全阐明。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)和自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosomepathway,ALP)是修复或清除异常蛋白最主要的两种机制。研究表明，泛素化蛋白的降解与自噬过程密切相关，2012年NatrureCellBiology最新发布的研究结果表明了自噬相关的VCP/p97蛋白在泛素依赖性蛋白降解循环过程中的重要意义。此外，与自噬体膜形成的关键蛋白LC3相互作用的接头蛋白p62能够募集寡聚化蛋白及多聚泛素化蛋白到自噬体中通过自噬-溶酶体途径降解。研究显示泛素化蛋白I-kBα的降解将诱发炎症反应，用自噬抑制剂氯喹抑制自噬可以达到抑制I-kBα的降解，NF-kBp65活化，从而达到抑制炎症的作用。另有报道也显示细胞自噬对炎症具有调控作用。p62作为一种连接性蛋白，含有多个蛋白结合位点，可通过羧基末端泛素结合位点与泛素化蛋白(包括I-kBα)结合，同时拥有LC3结合位点，可以与自噬调节蛋白ATG8/LC3相互作用，通过p62的介导，越来越多的蛋白被发现可以通过自噬-溶酶体途径而被选择性的降解。不过，过去以来自噬对泛素化蛋白介导的炎症的调控作用还未被深入研究，尤其在脊髓损伤的修复与重建中的意义还未被探讨。氯喹(CQ)是一个古老而应用广泛的抗疟疾药物，已被报道作为一种自噬抑制剂用于各种疾病，包括阿兹海默病和脑创伤。研究表明氯喹可以提高溶酶体PH值，抑制自噬体与溶酶体的融合，以及自噬溶酶体内蛋白的降解，Amaravadi等研究发现氯喹(5uM)可以抑制自噬降解，而Maclean等则认为氯喹(50uM)可以直接导致肿瘤细胞死亡，且既有凋亡的特征又有自噬性死亡的特征。因此推测正是由于不同浓度的氯喹对细胞起着不同的自噬作用而造成了上述截然不同的研究结果。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供氯喹在促进脊髓损伤修复中的应用，其中氯喹及其组合物包含氯喹及其医药学上可接受之载剂、佐剂或媒剂，其作为一种自噬抑制剂具有抑制自噬的效果，可避免神经元细胞过度自噬并进而过度凋亡，从而达到促进脊髓损伤修复的作用。本专利技术的另一目的在于提供氯喹在抑制炎症反应中的应用，其中氯喹及其组合物通过抑制自噬而抑制炎症反应。本专利技术的另一目的在于提供氯喹亦适用于p62介导的自噬调控炎症反应及其在生物学及病理学上的应用。本专利技术的另一目的在于提供一利用氯喹治疗脊髓损伤的方法，其中使用皮下注射氯喹及/或其组合物给药。为达到本专利技术的至少一个目的，本专利技术提供一氯喹在促进脊髓损伤修复的应用，其中氯喹如下式所示：进一步地，氯喹通过抑制自噬调控的炎症实现。进一步地，氯喹抑制泛素化蛋白I-kBα降解，从而通过抑制自噬调控的炎症促进脊髓损伤修复。优选地，所述泛素化蛋白I-kBα在p62介导的自噬调控炎症LC3-II-p62-I-kBα反应机制调控下，进一步地引入氯喹，以干预泛素化蛋白I-kBα的降解。相应地，可以理解的是，所述的氯喹包含其医药学上可接受之载剂、佐剂或媒剂。附图说明图1A-1B是大鼠脊髓损伤模型的建立及评价，其中图1A为BBB评分结果；图1B为不同时间点组织切片的HE染色结果。图2A-2C是大鼠脊髓损伤后行为学水平及组织学水平的检测，其中图2A为于1、3、7、14、21d各时间点，以BBB评分评价大鼠后肢活动水平；图2B为HE染色、尼氏染色及NeuN免疫荧光神经元染色，取7d各组大鼠脊髓组织用于染色检测；图2C为NeuN免疫荧光染色统计图。图3A-3D是氯喹抑制脊髓损伤大鼠细胞自噬及炎症作用研究，其中图3A为以蛋白质印迹法(Westernblot)检测自噬标记性蛋白LC3-II、泛素化蛋白I-kBα及炎症因子TNF-α水平的结果；图3B为LC3-II柱状分析图；图3C为I-kBα柱状分析图；图3D为TNF-α柱状分析图。具体实施方式以下描述用于揭露本专利技术以使本领域技术人员能够实现本专利技术。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本专利技术的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本专利技术的精神和范围的本文档来自技高网...

【技术保护点】
氯喹在促进脊髓损伤修复中的应用，其中氯喹如下式所示：

【技术特征摘要】
1.氯喹在促进脊髓损伤修复中的应用，其中氯喹如下式所示：2.根据权利要求1所述的应用，其中氯喹通过抑制自噬调控的炎症实现。3.根据权利要求2所述的应用，其中氯喹通过抑制自噬，从而抑制泛素化蛋白I-kBα降解，抑制NF-kBp65活化，从而抑制炎症，实现抑制自噬调控的炎症促进脊髓损伤修复的作用。4.根据权利要求3所述的应用，其中泛素化蛋白I-kBα在p62介导的自噬调控炎症LC3-II-p62-I-kBα反应机制调控下降解，进一步地引入氯喹，以干预泛素化蛋白I-kBα的降解。5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其中所述的氯喹包含其医药学上可接受之载剂、佐剂或媒剂。6.根据权利要求3所述的应用，其中利用免疫荧光法检测NF-kBp65活化水平，并检测炎症因子IL-6、TNF-α的表达量，比较各实验组脊髓组织中炎症因子的表达差异。7.根据权利要求6所述的应用，其中RT-PCR检测M1型促炎性巨噬细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬芬赞，肖健，张宏宇，魏晓捷，童松林，
申请(专利权)人：邬芬赞，
类型：发明
国别省市：浙江,33