并行比较微生物群落结构的分子生态监测方法技术

并行比较微生物群落结构差异的分子生态监测方法属于微生物生态学领域。监测方法具体如下：（１）选定ｒｅｐ－ＰＣＲ引物；（２）环境样品中混合微生物总基因组ＤＮＡ的提取；（３）ｒｅｐ－ＰＣＲ循环反应；（４）ｒｅｐ－ＰＣＲ产物纯化，浓度测定；（５）纯化产物标记为探针；（６）待测生态系统微生物混合ＤＮＡ的ｒｅｐ－ＰＣＲ产物经１．２～１．５％琼脂糖凝胶电泳；（７）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－Ｂｌｏｔ检测，即印迹杂交检测。本发明专利技术具有简便、快速、灵敏的特点，可以同时平行分析不同生态系统的种群结构差异以及同一生态系统微生物种群结构的动态变化，为发现、鉴别和分离生态系统中优势功能菌以及为调控生态系统功能提供监测方法，可找到能显著提高活性污泥降酚能力的优势菌种，也可设计特异性检测肠道功能菌的探针和引物来评价益生素等的药效及筛选药物等。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种微生物群落结构特征的分子生态监测方法，特别是一种并行比较微生物群落结构差异的分子生态监测方法，属于微生物生态学领域。
技术介绍
微生物在许多国民经济生产部门中具有重要地位，例如生物医药(动物、人体保健)、生物农药(植物内生菌)、轻工食品和环境保护等领域都是利用微生物进行生产活动的，而且在多数情况下，这些生产部门的生产活动所依赖的是多种微生物组成的微生物群落的功能。长期以来，在利用微生物生态系统进行生产活动的许多行业部门，受所使用的微生物分离培养技术的限制，无法全面、客观认识系统中的群落成员，无法及时动态跟踪系统成员种群数量变化对系统功能的影响，生产效率不仅低，而且不稳定。而通过分析微生物群落的总基因组DNA的组成，可以比较客观地认识微生物群落的结构。可以用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列信息包括16S rDNA(核糖体小亚基基因)序列、已知功能基因的序列、重复序列以及随机基因组序列等。由于16SrDNA中包含了相应细菌种类的系统分类地位的信息，因此，以16S rDNA为对象可以比较准确地分析微生物群落的种群结构组成。经文献检索发现Susan E.Pryde，Anyhony J.Richardson，Colin S.Stewart，and Harry J.Flint.1999.Molecular Analysis of the Microbial Diversity Present in the Colonic Wall，Colonic Lumen，and Cecal Lumen of a Pig.Appl.Environ.Microbiol.655372-5377，(对存在于猪的结肠壁、结肠内和盲肠内的微生物多样性的分子分析。应用与环境微生物学，65卷，5372-5377页。)一种常用的技术是构建基因文库。例如，根据16S rDNA在进化上的保守性特点设计具有不同专一性的通用引物，扩增环境中所有细菌或某一个类群细菌的16S rDNA，将扩增产物克隆到载体上构建成基因文库，通过分析一定数量的克隆子的序列以及它们的出现频率，可以在一定程度上了解环境样品中的主要细菌类群及其出现丰度等种群结构信息。这种方法需要进行克隆、测序等分子水平的工作，需要良好的实验条件和专用设备，耗费人力、财力和时间都较大，难以在医院、工厂等实际生产场所应用。另外，由于PCR扩增的偏好性，对生态系统样品中的种群结构的测度准确性也不特别高。又发现第二种常用的依赖16S rDNA的群落结构分析技术Dicello F.，Bevivino A.，Chiarini L.，Fani R.，Paffetti D.，TabacchioniS.and Dalmastri C.1997.Biodiversity of a Burkholderia cepacia populationisolated from the maize rhizosphere at different plant growth stages.Appl.Environ.Microbiol.634485-4493.(从不同生长期的玉米根际分离得到的洋葱伯克霍尔德氏菌群的生物多样性研究。应用与环境微生物学，63卷，4485-4493页。)该技术是提取环境样品中的总DNA，用通用引物扩增16S rDNA，用各种限制性内切酶对扩增产物进行酶切分析，由于不同的群落内微生物种类组成不同，其酶切图谱也就不同，这样可以得到反映微生物群落结构组成特征的DNA凝胶电泳图谱，由于这种方法只能从分子量大小上对酶切产物进行分离，当比较两个不同微生物群落的结构差异时，图谱相似的群落，其种群组成不一定相同。目前基于16S rDNA扩增用的较多的还有通过温度梯度凝胶电泳或变性梯度凝胶电泳分析PCR扩增得到16S rDNA可变区(如V3区)序列的多样性，从而反映微生物区系的复杂性。但这种方法也只能对大小为500bp以下的序列进行有效分离，而且当微生物种类过多时，同一个条带可以包含多个种类的DNA信息，因此，不能做到在较高的分辨率下分析比较微生物群落结构的差异。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种并行比较微生物群落结构差异的分子生态监测方法，所涉及用rep-PCR(重复序列聚合酶链式反应)扩增技术及混合探针分子杂交的方法，同时比较各种生态环境中微生物群落结构的差异及同一生态系统中微生物种群结构的时空动态变化，使本专利技术所涉及的rep-PCR及混合探针杂交的技术具有简便、快速、灵敏的特点，可同时分析比较多个微生物生态系统的结构差异及同一生态系统微生物种群结构的动态变化。本专利技术将rep-PCR技术应用到研究自然界复杂环境样品中，不经纯培养直接提取环境样品中微生物的混合的总的基因组DNA，其中DNA分子的种类及各分子的相对比例反应了环境样品中菌群的种类数量及种群之间的相对比例，这样便提取到生态系统中微生物群落结构的组成信息。不同的环境样品DNA分子的组成及相对数量不同，重复序列在不同基因组DNA分子中分布及拷贝数均不相同，这种差异可以反应在rep-PCR获得的指纹图谱中。在多种细菌组成的微生物群落中，各种细菌当其种群数量超过总数量的1-10％时，其特征性rep-PCR主条带就可以在群落结构DNA指纹图中表现出来。因此，在得到的rep-PCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种不同微生物的基因组DNA片段组成，条带的数目反映微生物类群的多少，每一条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低，这样，生态系统中微生物群落的结构信息，就被间接地记录在rep-PCR的指纹图谱中。因此，分析不同环境样品中微生物混合DNA经rep-PCR获得的指纹图谱的差异，就可分析比较不同生态系统微生物群落的结构的差异，或者同一个群落在不同功能状态下的种群结构的变化情况。对于复杂的环境样品，电泳分析rep-PCR扩增得到的不同生态系统微生物群落指纹图谱，不同系统中有很多条带具有相同的电泳特性但其序列组成信息不同，仅从电泳图上只能分析DNA条带大小信息，不能看到更深层次的序列信息，为此我们发展了混合探针杂交的技术，选取要分析比较的多个生态系统微生物群落之一，将其rep-PCR扩增得到的所有条带回收后标记为混合探针，然后与其它各系统用相同方法获得的指纹图谱杂交。该方法既可以看到不同生态系统微生物指纹图谱的条带大小差异也可以看到各条带的序列信息的差异，从而可以实现对微生物群落结构的分析和比较，因此，称其为微生物群落结构探针技术。本专利技术是一种基于rep-PCR和混合探针标记的分子杂交技术，通过rep-PCR得到微生物生态系统的DNA指纹图谱，该图谱间接反应生态系统中的微生物种群结构状况，取目标生态系统的一个典型的指纹图谱中的所有条带的DNA片段标记为混合探针，与其它生态系统用相同方法获得的指纹图谱进行分子杂交，可分析比较不同生态系统中微生物种群的结构差异及同一系统中的微生物种群结构的时空动态变化，得到反映某种功能状态下的微生物生态系统的结构的分子图谱特征，该特征可以用于判断和预测生态系统的功能变化趋势，为使用各种手段调控微生物生态系统的功能提供分子监测方法；把与功能特征相关的种群的特征性条带中的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种并行比较微生物群落结构分子生态的监测方法，其特征在于监测方法具体如下： （１）选定ｒｅｐ－ＰＣＲ引物； （２）环境样品中混合微生物总基因组ＤＮＡ的提取； （３）ｒｅｐ－ＰＣＲ循环反应； （４）ｒｅｐ－ＰＣＲ产物纯化，浓度测定； （５）纯化产物标记为探针； （６）待测生态系统微生物混合ＤＮＡ的ｒｅｐ－ＰＣＲ产物经１．２～１．５％琼脂糖凝胶电泳； （７）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－Ｂｌｏｔ检测，即印迹杂交检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立平，魏桂芳，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]