转基因微藻及其作为用于递送干扰RNA分子的饲料的用途制造技术

本发明专利技术提供了表达至少一种异源RNAi分子的非繁殖转基因微藻。表达RNAi的非繁殖转基因微藻用于将RNAi分子以其完整和功能形式口服递送至靶生物体。微藻内存在的异源RNAi分子的特征在于为生物活性的、对摄取微藻的生物体或所述生物体的病原体施加至少一种特定的作用。特别地，非繁殖转基因微藻用作动物和植物害虫的生物防治剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转基因微藻及其作为用于递送干扰RNA分子的饲料的用途专利
本专利技术涉及包含异源RNA干扰(RNAi)分子的非繁殖转基因微藻(non-propagatingtransgenicmicroalgae)及其用于将RNAi分子递送至摄取转基因微藻的靶生物体或经由被喂食或暴露于表达RNAi分子的微藻的居间(intervening)生物体摄取转基因微藻的靶生物体，特别地用于动物害虫或植物害虫的生物防治的用途。专利技术背景RNA干扰(RNAi)为与靶基因的特定区域同源的包含有义RNA和反义RNA的双链RNA(dsRNA)影响靶基因转录物的裂解，导致其功能的抑制的现象。它被发现于线虫(nematode)秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中(Guo,S.和Kemphues,K.J.1995.Cell81:611-620)，并且之后被证明存在于布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、果蝇属(Drosophila)、脉孢菌属(Neurospora)、植物细胞和哺乳动物细胞中(Wianny,F.和Zernicka-Goetz,M.2000.NatCellBiol2:70-75；CogoniC.2000.CurrOpinGenetDev10(6):638-43；Kennerdell.2000.NatBiotechnolAug；18(8):896-8)。RNAi由RNA诱导沉默复合物(RISC)控制，并由细胞的细胞质中的dsRNA分子启动。dsRNA分子的来源可以是外源的或内源的。切酶(Dicerenzyme)将dsRNA分子裂解为～20个核苷酸的短双链片段，其被称为小干扰RNA(siRNA)。这些短聚合物诱导互补mRNA的裂解。RNAi已被证明为在数个研究领域中非常有前景的工具，例如在基因组学中用于真核生物中的基因功能确定和基因敲低(geneknockdown)。在生物技术方面，RNAi因为其高特异性显示出大的潜能，使其能够在医学中使用用于特异性控制癌症和病毒疾病以及在农业和水产养殖的害虫防治中使用。微藻(microalgae)(单细胞藻类(alga)或浮游植物)代表了地球上最大、但最未被了解的微生物界。就像植物对于陆生动物一样，微藻代表水生食物链中的天然营养基础和所有植物营养物质的主要来源。藻类可以用作产生生物活性分子，包括遗传工程化的酶、疫苗或其他蛋白的有效平台。产生的分子可以从微藻中提取，或者可以在微藻内口服递送至靶生物体。已经报道了藻类中重组蛋白的表达，并且多种方法可用于在藻类细胞内产生外源蛋白，包括在细胞质体内的表达。美国申请公布第2008/0107652号公开了转基因微藻用于预防、改善或治疗水生动物中的疾病的用途。转基因藻类被直接地或间接地喂食至水生动物。该系统被提议用于递送免疫原性肽、单链抗体片段和DNA疫苗。核酸分子已经作为多功能工具出现，具有在多种生物化学、诊断和治疗应用中的有前景的效用。然而，由于缺乏有效的递送系统，这些分子的使用仍然稀少。通过喂食的核酸递送系统的成功开发受到多种屏障的挑战，其中最重要的障碍之一为肠粘膜。肠粘膜用作物理屏障和生物化学屏障两者，将外部环境与身体的内部环境分开。美国专利第8,633,028号公开了dsRNA在甲壳动物(crustaceans)和其他无脊椎动物中诱导的特异性和非特异性免疫。所提供的系统和方法包括用靶向感染虾的病毒的dsRNA处理虾。在一个说明的实施方案中，被注射至海产虾凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中的dsRNA阻断了病毒感染。然而，通过注射肠胃外施用核酸是不方便的，因为涉及风险并且还因为接受者的疼痛和恐惧。已经提出了用于肠胃外施用核酸的多种其他方法。例如，美国专利第8,524,679号公开了经由细胞间转移将核酸，包括dsRNA体内递送至哺乳动物靶细胞的方法。核酸的递送为通过直接转染动物细胞。美国专利第8,445,456号公开了介导RNA干扰的核酸分子用于治疗或降低疼痛的用途。然而，此专利技术公开了核酸分子通过注射被施用至患者。当靶生物体为水生动物或大量陆生动物时，肠胃外施用实际上为不可能的。已经测试了RNAi剂的另外的应用模式。例如，美国专利第8,404,832号公开了口服施用siRNA，其中siRNA链为化学修饰的。用于口服递送的另一个实例在携带被设计为靶向寄生线虫(南方根结线虫(Meloidogyneincognita))中的特定基因的dsRNA的转基因植物中被证明。在侵入到转基因植物细胞后，线虫摄取其细胞质并且由于dsRNA的RNAi活性死亡。因此转基因植物高度耐受线虫(Yadav等，MolBiochemParasitol.2006.148(2):219-22，Klink等Planta.2009.230(1):53-71)。已经证明了使用RNAi用于保护作物植物免受昆虫食草动物的可行性(PriceDR和GatehouseJA.2008.TrendsinBiotechnology26(7):393-400；KatochR.等，2013.ApplBiochemBiotechnol171:847–873)。该方法依赖于将双链RNA(dsRNA)注入到昆虫血腔中(这在田间条件下不实用)，或者依赖于在饮食中直接喂食dsRNA，造成dsRNA不稳定性的问题。因此，开发在昆虫中稳健的dsRNA喂食方法为利用这种技术的先决条件。美国申请公布第2013/0315883号公开了在转基因植物包括微藻中表达沉默RNA用于遗传防治寄生虫和病原体。此专利技术利用植物以有效摄取的形式在叶绿体内表达沉默RNA的能力，在摄入之后所述沉默RNA能够在叶绿体内起作用以抑制病原体或寄生虫内靶基因的表达。转基因植物领域中的主要缺点之一为需要具有用于产生每一种转基因作物类型的特定手段(means)，但是一种类型的转基因藻类可以用于保护任何期望的作物。另外，关于遗传修饰的植物和藻类对环境的影响存在越来越多的公众关注。植物和藻类的可再生性质可能导致它们扩散到自然环境中，用外来基因污染野生型物种。昼夜节律时钟控制生物体中的许多代谢和行为过程。在昆虫中，这些时钟及其分子机制已经被发现以许多不同的方式影响生殖。生殖行为，包括求偶、交尾和产卵(eggdeposition)，受到日节律的强烈影响(TobbackJ.等，2011.InsectBiochemistryandMolecularBiology41(5):313-321)。在哺乳动物和昆虫的昼夜节律调节网络中的核心基因之一被命名为“clock”(clk)。与其他昆虫相比，靶向以使clk基因沉默的双链RNA(dsRNA)的注射以剂量依赖性方式对沙漠蝗(desertlocust，Schistocercagregaria)的成虫和五龄若虫为致死的。clk-敲低的五龄若虫能够经历它们的成虫蜕皮，但取决于dsRNA的量，这花费它们比对照更长的时间达到成年期。作为成虫，clk-敲低的动物不像对照动物那样发育其脂肪体和卵巢(TobbackJ等2012.InsectMolecularBiology21(3):369–381)。通过喂食施用介导RNAi的核酸分子为用于基因沉默的最期望的方法之一；然而这种递送方法的实用性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非繁殖转基因微藻，所述非繁殖转基因微藻包含至少一种异源RNAi分子，其中所述RNAi分子靶向异种生物体内存在的多核苷酸，并且其中当所述微藻被所述异种生物体或被所述异种生物体的宿主摄取时，所述RNAi分子使所述异种生物体内存在的所述多核苷酸的表达沉默。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.14 US 62/192,0821.一种非繁殖转基因微藻，所述非繁殖转基因微藻包含至少一种异源RNAi分子，其中所述RNAi分子靶向异种生物体内存在的多核苷酸，并且其中当所述微藻被所述异种生物体或被所述异种生物体的宿主摄取时，所述RNAi分子使所述异种生物体内存在的所述多核苷酸的表达沉默。2.根据权利要求1所述的非繁殖转基因微藻，其中所述非繁殖转基因微藻呈干燥的形式。3.根据权利要求1-2中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述非繁殖转基因微藻包含多个拷贝的所述RNAi分子。4.根据权利要求1-3中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子在所述非繁殖转基因微藻的细胞核内被转录。5.根据权利要求1-4中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子靶向选自由以下组成的组的多核苷酸：对所述异种生物体内源的多核苷酸和对所述异种生物异源的多核苷酸。6.根据权利要求1-5中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链一起形成双链体，所述有义链包含与所述异种生物体内存在的所述多核苷酸具有至少95％同一性的至少19个连续核酸。7.根据权利要求5-6中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子靶向对所述异种生物体内源的多核苷酸，并且其中所述异种生物体为害虫。8.根据权利要求7所述的非繁殖转基因微藻，其中所述害虫为植物害虫。9.根据权利要求8所述的非繁殖转基因微藻，其中所述植物害虫属于选自由以下组成的组的目：直翅目(Orthoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和鞘翅目(Coleoptera)。10.根据权利要求9所述的非繁殖转基因微藻，其中所述植物害虫为选自由以下组成的组的蝗虫：沙漠蝗(Schistocercagregaria)和飞蝗(locustamigratoria)。11.根据权利要求10所述的非繁殖转基因微藻，其中所述植物害虫为沙漠蝗，并且其中所述RNAi分子靶向clk基因，所述clk基因包含在SEQIDNO:1中列出的核酸序列。12.根据权利要求11所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子包含有义链和反义链，所述有义链包含SEQIDNO:2中列出的核酸序列或其片段，所述反义链与所述SEQIDNO:2或其片段互补。13.根据权利要求12所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子包含有义链、接头序列和反义链，所述有义链包含SEQIDNO:2中列出的核酸序列；所述接头序列包含SEQIDNO:6中列出的核酸序列；所述反义链包含SEQIDNO:3中列出的核酸序列。14.根据权利要求7所述的非繁殖转基因微藻，其中所述害虫为动物害虫。15.根据权利要求14所述的非繁殖转基因微藻，其中所述动物选自由以下组成的组：水生动物和陆生动物。16.根据权利要求5-6中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子靶向对所述异种生物体内源的多核苷酸，所述异种生物体为摄取所述非繁殖转基因微藻的宿主动物的病原体。17.根据权利要求16所述的非繁殖转基因微藻，其中所述宿主动物选自由以下组成的组：鱼类、甲壳动物、家养农场动物和宠物。18.根据权利要求17所述的非繁殖转基因微藻，其中所述宿主动物为鱼类或甲壳动物，并且所述病原体为管口目(Siphonostomatoida)的桡足类(copepod)。19.根据权利要求18所述的非繁殖转基因微藻，其中所述桡足类属于纲鱼虱科(Caligidae)。20.根据权利要求19所述的非繁殖转基因微藻，其中所述宿主动物为鲑科(Salmonidae)鱼类，并且所述病原体为海虱(鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirussalmonis))。21.根据权利要求17所述的非繁殖转基因微藻，其中所述宿主动物为家禽，并且所述病原体为短角鸟虱科(Menoponidae)的家禽寄生虫。22.根据权利要求21所述的非繁殖转基因微藻，其中所述家禽寄生虫选自由以下组成的组：大鸡虱(Menacanthusstramineus)和鸡羽虱(Menopongallinae)。23.根据权利要求5-6中任一项所述的非繁殖转基因微藻，其中所述RNAi分子靶向对所述异种生物体异源的多核苷酸，并且其中所靶向的多核苷酸属于感染所述异种生物体的病毒。24.根据权利要求23所述的非繁殖转基因微藻，其中所述异种生物体选自由以下组成的组：鱼类、甲壳动物、家养农场动物和宠物。25.根据权利要求24所述的非繁殖转基因微藻，其中所述异种生物体为甲壳动物，并且所述病毒为白斑综合征病毒(WSSV)。26.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥芙拉·陈，
申请(专利权)人：特郎萨格以色列有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL