增强木糖的微藻代谢制造技术

本文提供重组微生物，所述重组微生物具有编码木糖异构酶的核酸序列的两个或更多个拷贝，其中编码所述木糖异构酶的所述核酸是外源核酸。任选地，所述重组微生物包含至少一个编码木酮糖激酶的核酸序列和/或至少一个编码木糖转运蛋白的核酸序列。所提供的重组微生物能够在作为碳源的木糖上生长。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增强木糖的微藻代谢相关申请的交叉引用本申请要求2015年7月13日提交的美国临时申请号62/191,983和2016年6月24日提交的美国临时申请号62/354,444的优先权权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。专利技术背景微生物的异养发酵是生成高价值油和生物质产品的有效方式。在某些培养条件下，微生物合成可被提取并用于生产燃料(例如,生物柴油、生物喷气燃料等)和营养脂质(例如，多不饱和脂肪酸如DHA、EPA和DPA)的细胞内油。由于高多不饱和脂肪酸(PUFA)和蛋白质含量，一些微生物的生物质具有巨大营养价值，并且可用作动物饲料的营养补充剂。破囊壶菌是可用于此类发酵过程以产生脂质的真核单细胞微生物。使用破囊壶菌的异养发酵将生长培养基中提供的有机碳转化成脂质，所述脂质在发酵过程结束时从生物质中收获。但是，现有微生物发酵主要使用昂贵的碳水化合物(如葡萄糖)作为碳源。专利技术概述本文提供重组微生物，所述重组微生物具有编码木糖异构酶的核酸序列的两个或更多个拷贝，其中编码所述木糖异构酶的所述核酸是外源核酸。任选地，所述重组微生物包含至少一个编码木酮糖激酶的核酸序列和/或至少一个编码木糖转运蛋白的核酸序列。所提供的重组微生物能够在作为碳源的木糖上生长。附图简述图1是木糖代谢途径的示意图。图2是示出在葡萄糖饥饿循环期间野生型ONC-T18中木糖异构酶的表达的图。图3是示出在葡萄糖饥饿循环期间野生型ONC-T18中推定木酮糖激酶的表达的图。图4是示出α-微管蛋白ble-异构酶质粒构建体的示意图。图5是示出α-微管蛋白hygro-xylB质粒构建体的示意图。图6是示出具有α-微管蛋白启动子、ble序列、2A序列、木糖异构酶序列和α-微管蛋白终止子的核酸构建体的示意图。图7是用于探测重组ONC-T18菌株“6”和“16”内的木糖异构酶His-标记的基因的DNA印迹的图像。图8是示出重组ONC-T18菌株中木糖异构酶His标记的基因插入的数量的qPCR测定的图。图9是用于探测含有木糖异构酶和木酮糖激酶两者(在图中称为“7-3”和“7-7”)的重组ONC-T18菌株内的xylB基因的DNA印迹的图像。图10是重组7-3和7-7ONC-T18菌株中xylB基因插入的数量的qPCR测定的图。图11是示出重组ONC-T18菌株“6”和“16”中木糖异构酶基因转录物的表达的图。图12是示出野生型ONC-T18和重组ONC-T18菌株“6”和“16”中的体外木糖异构酶活性的图。图13是示出仅编码木糖异构酶的重组ONC-T18菌株“16”以及编码木糖异构酶和木酮糖激酶的重组ONC-T18菌株“7-3”和“7-7”的体外组合木糖异构酶和木酮糖激酶活性的图。图14A和14B是示出重组ONC-T18菌株“16”(正方形)中的木糖摄取改善和木糖醇产生降低的图。野生型(WT)菌株由菱形表示。图15A和15B是示出重组ONC-T18菌株“16”(正方形)以及重组ONC-T18菌株“7-3”(三角形)和“7-7”(星号)中的木糖使用改善和木糖醇产生降低的图。野生型(WT)菌株由菱形表示。图16是示出在用重组ONC-T18菌株“16”和重组ONC-T18菌株“7-7”进行葡萄糖:木糖发酵期间木糖醇积聚的图。图17是用于转化ONC-T18的构建体的不同型式的示意图。图18是示出来自大肠杆菌(SEQIDNO:20)的xylB序列与大肠杆菌xylB的密码子优化型式(SEQIDNO:5)的比对的图。图19A、19B和19C是示出在包含木糖异构酶、木酮糖激酶和糖转运蛋白Gxs1的菌株中的木糖使用(图19A)、葡萄糖使用(图19B)和制备的木糖醇百分比(图19C)的图。WT是野生型；IsoHisXylB“7-7”含有木糖异构酶和xylB序列，36-2、36-9和36-16是含有Gxs1、木糖异构酶和xylB序列(木酮糖激酶)的转化体。图20A和20B是示出在木糖(菱形)和木酮糖(正方形)情况下，温度孵育对来自T18(图20A)和大肠杆菌(图20B)的异构酶活性的影响的图。图21A和21B是示出在木糖(菱形)和木酮糖(正方形)情况下，来自T18(图21A)和大肠杆菌(图21B)的异构酶的剂量依赖性的图。图22A和22B是示出用木糖异构酶(“16”(正方形)，“B”(x)和“6”(十字形))工程化的T18B菌株中的木糖使用(图22A)和降低的木糖醇产生(图22B)的图。图22C(木糖)和22D(木糖醇产生)示出在4天(灰色)和7天(黑色)时相对于野生型(菱形)表示的相同数据。图23A和23B是示出用木糖异构酶“16”工程化的T18B菌株(正方形)和工程化为表达木糖异构酶和木酮糖激酶“7-7”(x)和“7-3”(三角形)的菌株中的木糖使用和木糖醇产生降低的图。图23C(木糖)和23D(木糖醇产生)示出在9天(灰色)和11天(黑色)时相对于野生型(菱形)的相同数据。图24是示出工程化以在发酵中表达木糖异构酶和木酮糖激酶“7-7”的T18B菌株中提高的木糖使用和降低的木糖醇产生的图。野生型菌株由菱形和虚线表示，并且菌株“7-7”由圆圈表示。图25是示出α-微管蛋白aspTx-neo和α-微管蛋白gxs1-neo构建体的示意图。图26A是用于探测用木糖转运蛋白Gxs1工程化的“7-7”T18B菌株内的Gxs1基因的DNA印迹的图像。图26B是用于探测用木糖转运蛋白AspTx工程化的“7-7”T18B菌株内的AspTx基因的DNA印迹的图像。图27A是示出用木糖异构酶、木酮糖激酶和Gxs1转运蛋白(三角形)或AspTx转运蛋白(圆圈)工程化的T18菌株中木糖的使用的图。菌株“7-7”由菱形表示。图27B是3种修饰的菌株中的每一种的木糖醇产生与木糖使用的比率的条形图。图27C是示出相对于菌株“7-7”的木糖使用的条形图。图27D是示出相对于菌株“7-7”制备的木糖醇产生的条形图。图28是示出野生型(WT)(菱形)、isohis菌株“16”(正方形)、菌株“7-7”(x)和转运蛋白菌株Gxs1(星号)以及AspTx(三角形)在含有木糖作为唯一碳源的培养基中的生长的图。图29A是示出在WT(正方形)、菌株“7-7”(三角形)以及转运蛋白菌株Gxs1(星号)和AspTx(十字形)的生长期间含有葡萄糖和木糖的替代原料中的剩余葡萄糖的图。图29B是示出当WT(正方形)、菌株“7-7”(三角形)以及转运蛋白菌株Gxs1(星号)和AspTx(十字形)在含有葡萄糖和木糖的替代原料上生长时随时间推移剩余的木糖和产生的木糖醇的图。专利技术详述微生物如破囊壶菌编码木糖代谢所需的基因。然而，微生物的先天代谢途径产生大量的糖醇木糖醇，其被分泌并潜在阻碍微生物的生长(参见图14，WT)。此外，螯合到木糖醇中的碳原子是在此过程(即脂质产生)中转移离开目标产物的原子。在自然界中，存在两种木糖代谢途径，即木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径和木糖异构酶/木酮糖激酶途径(图1)。破囊壶菌具有编码在两种途径中均有活性的蛋白质的基因；然而，当在木糖培养基中生长时，前者途径似乎是占优势的，如由木糖醇的积聚所证明。在其他生物体中，已经显示木糖醇的积聚是由于木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径所需的氧化还原辅因子不平衡所致。由于异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组微生物，其包含编码木糖异构酶的核酸序列的两个或更多个拷贝，其中所述编码木糖异构酶的核酸是外源核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.13 US 62/191,983;2016.06.24 US 62/354,4441.一种重组微生物，其包含编码木糖异构酶的核酸序列的两个或更多个拷贝，其中所述编码木糖异构酶的核酸是外源核酸。2.如权利要求1所述的重组微生物，其还包含至少一个编码木酮糖激酶的核酸序列。3.如权利要求2所述的重组微生物，其中编码所述木酮糖激酶的所述核酸序列是外源核酸序列。4.如权利要求1至3中任一项所述的重组微生物，其还包含至少一个编码木糖转运蛋白的核酸序列。5.如权利要求4所述的重组微生物，其中编码所述木糖转运蛋白的所述核酸序列是外源核酸序列。6.如权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物还包含编码木酮糖激酶的核酸序列的至少两个或更多个拷贝和至少一个编码木糖转运蛋白的核酸序列。7.如权利要求1至6中任一项所述的重组微生物，其中编码所述木糖异构酶的所述核酸序列是异源核酸。8.如权利要求1至7中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含所述编码木糖异构酶的外源核酸序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个拷贝。9.如权利要求1至8中任一项所述的重组微生物，其中编码所述木糖异构酶的所述异源核酸序列与SEQIDNO:2至少90％相同。10.如权利要求2至9中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含编码所述木酮糖激酶的所述核酸序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个拷贝。11.如权利要求4至10中任一项所述的重组微生物，其中所述编码木酮糖激酶的核酸序列是异源核酸。12.如权利要求11所述的重组微生物，其中编码所述木酮糖激酶的所述异源核酸序列与SEQIDNO:5至少90％相同。13.如权利要求5至12中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含编码所述木糖转运蛋白的所述核酸序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个拷贝。14.如权利要求5至13中任一项所述的重组微生物，其中编码所述木糖转运蛋白的所述核酸是异源核酸。15.如权利要求14所述的重组微生物，其中由所述异源核酸编码的所述木糖转运蛋白是来自中间假丝酵母(Candidaintermedia)的GXS1。16.如权利要求14所述的重组微生物，其中编码所述木糖转运蛋白的所述异源核酸序列与SEQIDNO:23至少90％相同。17.如权利要求1至16中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物具有与非重组对照微生物相比增加的木糖转运活性、与非重组对照微生物相比增加的木糖异构酶活性、与非重组对照微生物相比增加的木酮糖激酶活性或其任何组合。18.如权利要求1至17中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物以木糖作为唯一碳源生长。19.如权利要求1至18中任一项所述的重组微生物，其中编码所述木糖异构酶的所述外源核酸序列可操作地连接至启动子。20.如权利要求11至19中任一项所述的重组微生物，其中编码所述木酮糖激酶的所述核酸序列可操作地连接至启动子。21.如权利要求14至20中任一项所述的重组微生物，其中编码所述木糖转运蛋白的所述核酸序列可操作地连接至启动子。22.如权利要求19至21中任一项所述的重组微生物，其中所述启动子是微管蛋白启动子。23.如权利要求22所述的重组微生物，其中所述启动子与SEQIDNO:25或SEQIDNO:26至少80％相同。24.如权利要求1至23中任一项所述的重组微生物，其中编码所述木糖异构酶的所述外源核酸序列包含终止子。25.如权利要求11至24中任一项所述的重组微生物，其中编码所述木酮糖激酶的所述核酸序列包含终止子。26.如权利要求14至25中任一项所述的重组微生物，其中编码所述木糖转运蛋白的所述核酸序列包含终止子。27.如权利要求24至26中任一项所述的重组微生物，其中所述终止子是微管蛋白终止子。28.如权利要求27所述的重组微生物，其中所述终止子与SEQIDNO:27、SEQIDNO:28或SEQIDNO:30至少80％相同。29.如权利要求1至28中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物还包含选择性标记。30.如权利要求29所述的重组微生物，其中所述选择性标记是抗生素抗性基因。31.如权利要求30所述的重组微生物，其中所述抗生素是博莱霉素、潮霉素B、卡那霉素或新霉素。32.如权利要求1至31中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物是破囊壶菌属(Thraustochytrium)或裂殖壶菌属(Schizochytrium)微生物。33.如权利要求32所述的重组微生物，其中所述微生物是ONC-T18。34.一种制备重组木糖代谢微生物的方法，所述方法包括：提供一种或多种核酸构建体，所述核...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山德拉·马瑞克斯雅克，大卫·伍德霍尔，马克·斯凯夫，罗伯托·E·阿门塔，丹尼斯·缪斯，霍利·拉斯穆森，杰里米·本杰明，
申请(专利权)人：玛拉可再生能源公司，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA