一种共生藻的检测探针制造技术

本发明专利技术公开了一种共生藻的检测探针，属于核酸检测领域。具体针对共生藻的ｒＲＮＡ特定区域合成以Ｓ１酶保护分析探针为核心的一组探针，联合Ｓ１酶保护分析和夹心杂交技术实现对共生藻ｒＲＮＡ的定性定量检测。所述检测探针包括三条相互关联的寡核苷酸探针：Ｓ１酶保护分析探针、抓捕探针、信号探针或者连接探针。本发明专利技术探针适用性好，大大方便了特异探针的寻找和实现。本发明专利技术的稳定性远远高于夹心杂交技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一组藻类检测的寡核苷酸探针，具体地说是针对一种共生藻定性与定量检测的特异性探针。属于核酸检测领域。
技术介绍
共生藻(Symbiodinium sp.)是一种经常在海洋无脊椎动物，如蛤、海葵、水母、有孔虫和造礁珊瑚虫等中发现的共生甲藻，它在无脊椎动物-微藻内共生环境中发挥着关键性的作用。作为一个全球性的环境问题，珊瑚礁的退化已引起越来越多的关注，而共生藻对于珊瑚虫获得充足的营养以形成钙质骨骼构造珊瑚礁发挥着至关重要的作用。因此，及时、准确、快速地检测海洋环境中共生藻的种群动态，随时了解其在海洋中的数量变化具有生态和环境两方面的重要意义。传统的利用光学显微镜直接观察和计数的鉴别方法，过程烦琐、费时、费力，并需要有经验的分类专家参与其中。当样品量多，生物多样性丰富，监测范围广时工作量极大，因此主要用于藻的定性和分离，而不适用于藻的定量与大范围监测研究。所以，发展用于快速、准确检测共生藻的新方法和新技术极具现实意义。但是，目前国际国内关于这方面的研究进展不大，尚未形成非常有效的对该藻进行定性和定量检测的成熟技术。由于rRNA被认为是与藻类的系统进化密切相关的序列，而且真核生物细胞中rRNA含量非常高，可以达到106～107个拷贝，rRNA是夹心杂交的很好的靶点。经对现有技术文献的检索发现，Christopher A.Scholin等在《利用rRNA在全细胞和“三明治”杂交中识别南方菱形藻》(美国《藻类学杂志》，1996，35(3)，190～197)一文中将提取的RNA或者藻细胞裂解液在一定条件下与结合在96孔板上的寡核苷酸探针杂交后，再用一标记的信号探针与之杂交，最后进行酶标抗体显色反应，取得了较满意的结果。该技术现在海洋藻类的监测中已经有所应用。但到目前为止，应用该技术能够检测的微藻只限于有限的几种(其中包括了共生藻)。其主要缺点是一，因捕获探针的长度仅10～30bp，因此能够有效区别亲缘关系较近的微藻的捕获探针数量极少；二，在整个检测过程中都需要防止RNA降解，然而洗涤、抗体反应等各步骤极易造成RNA降解，因此操作难度大、检测结果波动性大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一组针对一种共生藻rRNA的特异性的共生藻的检测探针，依据这组探针对该藻进行S1酶保护分析和夹心杂交检测，实现对该藻的快速定性和定量。本专利技术用于对该藻进行S1酶保护分析和夹心杂交检测，具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针S1酶保护分析探针、抓捕探针、信号探针或者连接探针，所述的S1酶保护分析探针，是指与共生藻rRNA互补而且用于S1酶保护分析方法的寡核苷酸探针，所述的抓捕探针，是指与S1酶保护分析探针的一端结合，这一端通常为3’端，另外一端标记有生物素，从而将经过S1酶酶切处理和变性处理后保留在溶液中的S1酶保护分析探针捕获下来的探针，所述的信号探针或者连接探针能够在抓捕探针捕获S1酶保护分析探针后，结合于S1酶保护分析探针的另一端的的探针为连接探针，同时该探针标记有可检测信号，或者在一端具有信号探针结合区，能够与通用信号探针互补。S1酶保护分析探针在进行生物信息学比对分析时，仅与该种共生藻核糖体小亚基1600～1700区域核苷酸互补，而与其它藻核糖体RNA无同源性，长度为59bp，在一定的条件下可特异性结合于共生藻的rRNA上，序列为5’-GGTTCATGAAGCTTTCCAACGCAACGTCCAGAAGCTGAGCACTGCGTCAGTCCGAATTA。通过测定共生藻的rRNA序列，进行多序列比较，寻找共生藻的特征序列，作为该藻的rRNA特异区域，然后根据该rRNA特异区域序列(特征序列)设计S1酶保护分析探针。寻找生物特异性区域的方法以及根据特异区域设计探针都采用现有技术。已有的实验表明，不同藻rRNA之间若存在2～3个以上核苷酸的连续错配或者缺失就可以作为特异探针设计的靶序列。抓捕探针特异性结合于S1酶保护分析探针一端，长度为24bp，序列特征为5’-TAATTCGGACTGACGCAGTGCTCA，在5’端标记有生物素、磷酸基团，或者氨基基团以及其他任何可以用来标记可以用于固定于固体基质的标记。信号探针或者连接探针在一端与S1酶保护分析探针互补，而在另一端具有通用信号探针互补区，与通用信号探针互补结合，长度为23bp，序列为5’-TGCGTTGGAAAGCTTCATGAACC；该序列上标记各种检测的信号，具体包括荧光素、地高辛、生物素用于信号检测的序列，或者与通用的信号探针互补的一段序列。通用信号探针与连接探针的一端(不同于与S1酶保护分析探针互补结合的一端)互补。常用的标记物包括(但并不限于)地高辛、荧光素、生物素或者辣根过氧化物酶等。简而言之，本专利技术是针对共生藻的rRNA特定区域合成以S1酶保护分析探针为核心的一组探针，联合S1酶保护分析和夹心杂交技术实现对共生藻rRNA的定性定量检测。本专利技术的这组探针可用于以S1酶保护分析和夹心杂交技术检测样品中是否存在共生藻及其数量，所述的检测过程包括下列步骤(a)待检测样品和S1酶保护分析探针的混合在该步骤中，可以将经裂解处理已释放出rRNA的待检测的微藻样品与S1酶保护分析探针混合。也可以将待检测的微藻样品与S1酶保护分析探针直接混合，然后再进行裂解处理，从而释放rRNA。一旦释放出的rRNA包含对应于S1酶保护分析探针的靶序列，经过杂交，则会与S1酶保护分析探针形成双链。(b)S1酶处理当S1酶保护分析探针与待检测生物的rRNA杂交后，用适当浓度(通常为0.5U～2U/μl，较佳地为1U/μl)的S1酶消化过量游离的探针；当该探针与其他非目标rRNA反应时，由于杂交体存在切口或小缺口，S1酶亦能将该探针切断；最终保留下与完全匹配的S1酶保护分析探针和共生藻的rRNA形成的DNA/RNA双链，而且该双链的量代表了样本中相应的rRNA的量。(c)DNA-RNA杂合体的变性将DNA/RNA双链杂合体变性为DNA单链(即S1酶保护分析探针)和RNA单链。合适的变性方法没有特别限制，可以用本领域常用的各种变性方法，例如热变性等。例如，加入中和溶液后加热，使S1酶保护分析探针和目标生物的rRNA形成的杂合体变性，从而释放出保留下来的S1酶保护分析探针。由于RNA不稳定，解链形成的RNA单链易被内源或外源的RNA酶降解。(d)捕获S1酶保护分析探针将保留有S1酶保护分析探针的溶液与预先固定于固相载体上的抓捕探针杂交，将S1酶保护分析探针特异地抓捕在固相载体上，并洗涤除去非特异的结合。(e)结合带可检测信号的探针用连接探针与被捕获的S1酶保护分析探针杂交，并洗涤除去非特异的结合，再用信号探针与连接探针结合，并洗涤除去非特异的结合。(f)信号检测可用本领域常规方法对可检测信号进行信号检测。例如信号探针上可以标记上荧光信号，这样通过激发荧光来读取数据；也可以在信号探针上标记上地高辛、荧光素或者生物素等，然后通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗体或者亲和素与之反应；最后加入发光底物或者显色底物(TMB或者NPP等)，通过探测发光强弱或者吸光度来判读信号。本专利技术的主要优点在于(1)探针适用性好夹心杂交特异识别的关键是抓捕探针的特异性，一般情况抓捕探针约长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种共生藻的检测探针，其特征在于，用于对该藻进行Ｓ１酶保护分析和夹心杂交检测，具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针：Ｓ１酶保护分析探针、抓捕探针、信号探针或者连接探针，所述的Ｓ１酶保护分析探针，是指与该种共生藻ｒＲＮＡ互补而且用于Ｓ１酶保护分析方法的寡核苷酸探针，所述的抓捕探针，是指与Ｓ１酶保护分析探针的一端结合，这一端通常为３’端，另外一端标记有生物素，从而将经过Ｓ１酶酶切处理和变性处理后保留在溶液中的Ｓ１酶保护分析探针捕获下来的探针，所述的信号探针或者连接探针能够在抓捕探针捕获Ｓ１酶保护分析探针后，结合于Ｓ１酶保护分析探针的另一端的的探针为连接探针，同时该探针标记有可检测信号，或者在一端具有信号探针结合区，能够与通用信号探针互补。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于志刚，李荣秀，蔡青松，米铁柱，甄毓，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]