本发明专利技术涉及生物医药领域，特别涉及细胞外组蛋白抑制血管生成及其对VEGF表达的影响。本发明专利技术从促进创伤修复效果出发，建立体外细胞实验，探索细胞外组蛋白在内皮细胞功能及血管形成方面的毒性作用。通过探索肝素对组蛋白的干预机制，并且探索了细胞外组蛋白对HUVEC细胞VEGF表达的影响，为创伤修复治疗提供新的思路与方法，填补了当年该技术领域探索的空白。
Inhibitory effect of extracellular histone on angiogenesis and its effect on the expression of VEGF
The present invention relates to the field of biological medicine, in particular to the inhibition of angiogenesis by extracellular histone and its effect on the expression of VEGF. Based on the promotion of wound healing effect, the present invention establishes in vitro cell experiments to explore the toxic effects of extracellular histones on endothelial cell function and angiogenesis. By exploring the intervention mechanism of heparin on histone, we explored the effect of extracellular histone on the expression of VEGF in HUVEC cells, and provided new ideas and methods for wound healing, which filled the gap in the technology field.
【技术实现步骤摘要】
细胞外组蛋白对血管生成的抑制及其对VEGF表达的影响
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及细胞外组蛋白对血管生成的抑制及其对VEGF表达的影响。
技术介绍
随着当今社会的发展，战争、恐怖袭击等暴力事件的突发，车祸及犯罪等灾难事件，使得创伤相应的增多。尽管近年来医疗技术有了很大进步，但严重创伤所造成死亡率并没有明显的下降，主要原因是我们对创伤修复机理了解的不透彻。创伤修复是机体的一种自我保护机制，在损失因子的刺激下，机体调动一切可能的手段，使损伤组织得以修复。此过程由细胞、细胞因子、细胞外基质等共同参与完成，并在机体调控下呈现高度的有序性、完整性和网络性。创伤修复过程是各种细胞增殖、分化、迁移、凋亡和消失的过程，与生长和组织再生的普遍现象密切相关，它包括四个相互重叠阶段：止血、炎症、组织形成和组织重建。皮肤是人体与外界环境间最重要的天然屏障，受损后必须进行修复，以使机体最大限度恢复到原来状态。受损后局部的缺氧会启动机体组织修复，同时慢性缺氧又会延缓所有的修复过程，所以血管系统的新生对创伤愈合起至关重要的作用。在创伤修复过程中，新生的毛细血管主要以出芽的方式形成，其中血管内皮细胞的增殖、迁移起主要作用。新生血管不仅供给修复细胞营养，还分泌各种调控因子。因此，新生血管形成是皮肤创伤修复的关键。在创伤修复过程中，血管新生有5个阶段：血管新生的诱导、炎症细胞的渗出、血管的新生、血管的重塑、血管新生的抑制。血管生成的发生和调节是个复杂的多因素过程，一方面通过血管形成刺激因子刺激内皮细胞的迁移和增殖诱导血管形成，或间接地作用于其他细胞而产生生长因子；另一方面血管形成抑制因子抑制血管形成。血管形成主要是由已有的血管“发芽”长出新的毛细血管，已有的血管袢也可能延长。新的毛细血管主要由小静脉长出，包括内皮细胞的移动、分化和成熟。创伤后新生血管化发芽是直接由内皮细胞形成：新生血管化刺激因子作用于残存的血管内皮细胞，使其伸出伪足，释放蛋白酶、降解基底膜后迁移，前沿的细胞不增殖而后面的细胞增殖，不断提供迁移的细胞，逐渐形成毛细血管芽。如阻断内皮细胞DNA复制，新生血管芽仍可形成，说明血管芽是由细胞迁移而不是增殖形成的。正常组织发挥功能需要通过血管供给充足的氧气。而血管生成对许多生理过程和病理过程至关重要，因此对血管形成的认识是一项具有挑战性的目标。解密血管生成机制将为创伤修复提供有效的治疗方式。组蛋白是真核生物细胞中染色质的结构蛋白，包括H1、H2A、H2B、H3和H4。组蛋白一旦由胞内异位至胞外则成为胞外组蛋白。胞外组蛋白主要来自如下两方面：由死亡的实质组织细胞释放。此时，染色质降解，细胞膜破裂、细胞溶解，大量核内组蛋白释至胞外；由白细胞、特别是中性粒细胞释放。在急性期反应中性粒细胞大量急剧增加而形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophilextracellulartraps,NETs)时，组蛋白随DNA和高迁移率族蛋白(HMGB1)等一起释放至细胞外。对组蛋白的研究涉及多种临床疾病，包括癌症、炎症性疾病、缺血性发作、自身免疫性疾病等，主要用于疾病的诊断分期、预后及监测判断疗效等方面。但是，对于组蛋白黑暗一面很少有研究报道，早在1958年James的研究中就指出组蛋白的毒性作用，而对细胞外组蛋白生物学毒性的研究近年来才受到人们的关注。肝素是常见的抗凝血剂，它也被成功地用于治疗炎症性疾病。肝素因为高度硫酸化而富含负电荷，组蛋白富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸，肝素特异性低但高亲和力的静电相互作用可能导致肝素对组蛋白的中和作用。Fuchs等研究提出肝素及硫酸乙酰肝素可以抑制组蛋白与血小板的相互作用，并且抑制组蛋白的内皮细胞毒性作用以及组蛋白引起的血小板减少。肝素还可有效阻断组蛋白引起的炎症反应，在有效治疗急性呼吸窘迫综合征方面具有很大潜力。外组蛋白可视为脓毒症死亡的主要介质，而非抗凝肝素与组蛋白的结合能够有效阻止组蛋白介导的细胞毒性作用并降低无菌炎症和脓毒症引起的死亡率。CRP是一种主要的急性时相蛋白。CRP能够保护机体免受循环组蛋白所造成的毒性。在体外，CRP显著减轻组蛋白引起的内皮细胞破坏、渗透性增加和血小板聚集。在体内，CRP具有抑制内皮细胞破坏、血管通透性增加以及凝血激活等作用。Abrams等发现CRP可以减少广泛细胞死亡后释放到循环中组蛋白的毒性作用。CRP对循环系统中组蛋白的去毒化已成为机体自我防御的机制之一。抗组蛋白抗体通过抗原-抗体结合中和细胞外的游离组蛋白和结合在DNA片段上的组蛋白，从而直接阻断组蛋白的生物学作用。在小鼠急性肾损伤模型，给予抗组蛋白H4抗体能明显减轻肾脏炎性损伤。但是抗组蛋白抗体尚未进入临床试验，其疗效也尚不确切。随着对细胞外组蛋白研究的不断深入，其在创伤修复方面的重要性也逐渐显现。阻断组蛋白从细胞内释放或者以组蛋白为靶点的干预可能有效地促进创伤修复，但是尚需要进一步研究和临床实践予以证实。目前无报道细胞外组蛋白抑制血管生成，也无关于肝素对此的保护作用；更无二者对于VEGF表达的影响。
技术实现思路
鉴于以上问题，本专利技术从促进创伤修复效果出发，建立体外细胞实验，探索细胞外组蛋白在内皮细胞功能及血管形成方面的毒性作用。通过探索肝素对组蛋白的干预机制，为创伤修复治疗提供新的思路与方法。本专利技术通过一系列实验发现细胞外组蛋白具有以下作用：对血管生成的作用，细胞外组蛋白可抑制血管的生成，肝素可起到拮抗作用。细胞外组蛋白可引起血管内皮细胞死亡，抑制细胞增殖及小管形成，而肝素可抑制外组蛋白诱导的内皮细胞凋亡。细胞外组蛋白可抑制HUVEC细胞VEGFmRNA水平的表达，而肝素可拮抗细胞外组蛋白对VEGFmRNA水平表达的影响。所使用实验手段为Real-timePCR。细胞外组蛋白可显著抑制HUVEC细胞VEGF蛋白水平的表达，而肝素可拮抗细胞外组蛋白对VEGF蛋白水平表达的影响。所使用的实验手段为WesternBlot实验。所选择的内皮细胞为HUVEC细胞。本专利技术的优点和有益效果在于：从促进创伤修复效果出发，建立体外细胞实验，探索细胞外组蛋白在内皮细胞功能及血管形成方面的毒性作用。通过探索肝素对组蛋白的干预机制，并且探索了细胞外组蛋白对HUVEC细胞VEGF表达的影响。为创伤修复治疗提供新的思路与方法，填补了当年该
探索的空白。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为小管形成实验结果。图2为Histone处理血管内皮细胞抑制血管生成，肝素可部分拮抗Histone的作用(小管形成实验的分析结果)。图3为RT-PCR实验提示加药1h，细胞外组蛋白可显著抑制HUVEC细胞VEGFmRNA水平的表达，而肝素可拮抗。图4为RT-PCR实验提示加药4h，细胞外组蛋白可显著抑制HUVEC细胞VEGFmRNA水平的表达，而肝素可拮抗。图5为WesternBlot实验结果。图6为WesternBlot实验灰度分析提示加药1h，细胞外组蛋白对HUVEC细胞VEGF蛋白水平的表达无明显影响，肝本文档来自技高网...
【技术保护点】
细胞外组蛋白对血管生成的作用，其特征在于，细胞外组蛋白可抑制血管的生成，肝素可起到拮抗作用。
【技术特征摘要】
1.细胞外组蛋白对血管生成的作用，其特征在于，细胞外组蛋白可抑制血管的生成，肝素可起到拮抗作用。2.细胞外组蛋白对血管生成的作用，其特征在于，细胞外组蛋白可引起血管内皮细胞死亡，抑制细胞增殖及小管形成，而肝素可抑制外组蛋白诱导的内皮细胞凋亡。3.细胞外组蛋白对VEGF表达的影响，其特征在于，细胞外组蛋白可抑制内皮细胞VEGFmRNA水平的表达，而肝素可拮抗细胞外组蛋白对VEGFmRNA水平表达的影响。4.细胞外组蛋白对VEGF表达的影响，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：王飞飞，
申请(专利权)人：上海懿贝瑞生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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