一种棉花原位杂交方法技术

本发明专利技术涉及一种棉花原位杂交方法，包括制片、制备探针、杂交前预处理、制备杂交液、杂交和检测六个步骤，其中，制片时用２％纤维素酶和０．５％果胶酶在３７℃下解离１～２．５小时，探针采用多色标记，杂交前杂交液需在９０～９７℃变性８～１０分钟，杂交时要在８０～８５℃共变性８～１０分钟。本发明专利技术所述的棉花原位杂交方法采用多色标记探针，能有效消除背景干扰，提高检测灵敏度和准确性。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种棉花原位杂交方法，它包括以下步骤：（１）制片：取棉花根尖，预处理，固定，然后用２％纤维素酶和０．５％果胶酶于３７℃下解离１～２．５小时，压片，－７０℃或液氮冰冻，干燥；（２）制备探针：提取ＤＮＡ或ＲＮＡ，纯化，剪切，电泳 分离目的片段，用荧光素进行多色标记，制得探针；（３）杂交前预处理：干燥制片，依次用１００ｕｇ／ｍｌ的ＲＮＡ酶和０．１％～０．０１％的胃蛋白酶处理，再用４％多聚甲醛固定，然后依次用７０％、９０％、１００％的乙醇脱水，晾干；（４ ）制备杂交液：杂交液总体积为２０ｕｌ：１００％去离子甲酰胺１０ｕｌ；５０％硫酸葡聚糖４ｕｌ；２０×标准柠檬酸钠盐２ｕｌ；１０％十二烷基磺酸钠１ｕｌ；用不同的荧光素标记的探针 各１ｕｌ；不足２０ｕｌ时用灭菌的去离子水补足；将杂交液混匀，于９０～９７℃变性８～１０分钟，转入冰水中处理１０～１５分钟。（５）杂交：将杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装，于８０～８５℃共变性８～１０分钟，转入３７℃ 水浴中杂交过夜。（６）检测：用标准柠檬酸钠盐洗脱，然后加与标记用的荧光素匹配的抗体衬染，用抗荧光衰减剂封片，观察荧光信号，采集并加工杂交图像。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王坤波，宋国立，刘方，王春英，张香娣，黎绍惠，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]