本发明专利技术公开了一种甘蓝型油菜Ｃ染色体组定向转基因的方法，其步骤是：Ａ．甘蓝农杆菌介导的遗传转化，首先是农杆菌菌液制备，其次是外植体制备，第三是将外植体置于农杆菌液中进行遗传转化，第四是除草剂抗性检测，第五是ＰＣＲ分子检测；Ｂ．转基因甘蓝型油菜的人工合成，首先是白菜细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，其次是甘蓝细胞质转基因甘蓝型油菜人工合成，最后是对人工合成的单倍体油菜进行染色体加倍；Ｃ．转基因油菜的鉴定。本发明专利技术操作简单，外源目的基因可准确无误地转到甘蓝型油菜Ｃ染色体上，所获得的转基因油菜，环境释放时外源转基因扩散的生态风险小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转基因植物生态安全研究领域，具体地说，本专利技术涉及基因定向转化方法，应用该方法获得的转基因油菜，环境释放时外源转基因扩散的生态风险小。
技术介绍
油菜是以收获种子榨油为目的的栽培十字花科芸薹属植物的统称，主要包括甘蓝型油菜(Brassica napus L.)、白菜型油菜(B.campestris L.)和芥菜型油菜(B.juncea Czern.et Coss.)。当今世界各国种植的油菜主要是甘蓝型油菜，其它类型油菜种植面积很小。现在所说的油菜如不特别说明，均指甘蓝型油菜。油菜是重要的油料作物，在世界油料作物生产中，仅次于大豆，居第二位。中国、印度、加拿大、澳大利亚、欧洲是世界主要油菜生产国。自1999年以来，中国油菜播种面积一直在1亿亩以上，总产量在1100万吨左右，中国是世界油菜第一生产大国，油菜种植面积和总产量均居世界第一位。1996年全球第一次大面积种植转基因抗除草剂作物，其后持续扩大，转基因作物迅速发展，到2004年全球转基因作物的种植面积达8,100万公顷，比9年前增加了47倍。2004年全球转基因作物种植面积的增长率为20％，连续9年增长率达两位数。2004年全球共17个国家(11个发展中国家及6个发达国家)825万农民种植8,100万公顷的转基因作物。转基因油菜的种植面积则由2002年的300万公顷增长至2005年的360万公顷，占全球转基因作物总种植面积的5％，主要集中在加拿大和美国。国内外大量的研究已证实在人工授粉和自然生态条件下，转基因油菜中的外源基因能够通过花粉传给其它有亲缘关系的芸苔属植物，如白菜类(小白菜、大白菜、菜薹、白菜型油菜等)(Brassica rapa或B.campestris)、芥菜类(芥菜、榨菜、芥菜型油菜等)(B.juncea)，且能在该物种种群中生存下来(刘后利，油菜的遗传和育种.上海上海科学技术出版社，19859～63；Scheffler JA，Dale PJ.Opportunities for gene transfer andorigin of crop Brassicas，a review.Opera Bot，1994a，553-57；Scheffler JA，DalePJ.Opportunities for gene transfer from transgenic oilseed rape(Brassica napus)to related species.Transgenic Res，1994b，3263-278)。在加拿大和欧洲许多国家，野生白菜类植物(B.rapa)还是农田优势种群杂草。在我国冬油菜产区和春油菜产区野生芥菜类(B.juncea)和白菜类(B.rapa)植物也是农田优势种群杂草。转基因甘蓝型油菜中的抗除草剂、抗虫、抗病等外源基因如果扩散到这类野生植物中，可能形成超级杂草，将会给生态环境带来不可预测的可怕后果，也会给农业生产带来不可估量的损失。由于转基因甘蓝型油菜的环境释放和商业化应用，转基因油菜中的外源目的基因(如抗除草剂、抗病、抗虫等外源基因)通过花粉扩散到自然界油菜野生近缘物种中形成“超级杂草”，造成生态平衡的破坏，引发生态灾难，引起人们广泛关注，也给转基因油菜推广应用带来很大阻力。因此，世界上除加拿大和美国已商业化种植转基因油菜多年，其他国家还没有转基因油菜商业化种植。甘蓝型油菜(B.napus，AACC，2n＝38)属于异源多倍体作物，是由白菜(B.rapa，AA，2n＝20)与甘蓝(B.oleracea，CC，2n＝18)自然杂交，染色体加倍，经过长期的自然进化和人工选择而形成现在人们广泛种植的栽培甘蓝型油菜(刘后利，油菜的遗传和育种.上海上海科学技术出版社，19859～63)。前人大量研究表明芸苔属AA染色体组白菜类物种与AC染色体组的甘蓝型油菜杂交较容易获得杂种，但杂交后代的自然结实率很低；AB染色体组的芥菜类植物与甘蓝型油菜杂交也比较容易，但杂种F1代不育或部分可育；甘蓝型油菜与C染色体组的甘蓝类植物杂交极为困难，自然条件下很难获得杂种(刘后利，油菜的遗传和育种.上海上海科学技术出版社，19859～63)。对于异源多倍体作物来说，只有某一套染色体和其近缘种具有杂交亲和性。比如，甘蓝型油菜的A染色体组和白菜类植物(B.rapa)、芥菜类植物(B.juncea)的A染色体组具有杂交亲和性，因而转基因甘蓝型油菜中的外源转基因很容易通过A染色体组转移到这一类植物中；但在自然条件下位于甘蓝型油菜C染色体组上的基因极少会转移到其相应的近缘物种中。因此，通过染色体定位转基因获得那些转基因插入到安全性较高染色体组的转基因作物进行产业化，可以在很大程度上降低产生超级杂草的生态风险。Metz等(1997)将转基因抗除草剂甘蓝型油菜作父本与芜菁(B.rapa)杂交，然后研究回交后代不同世代的外源基因消失速度，2个转bar基因甘蓝型油菜品系研究结果明显不同，1个品系回交后代的抗除草剂植株减少快，表示外源bar基因快速丢失，难以整合到芜菁(B.rapa)基因组中(Metz PLJ，Jacobsen E，Nap JP，Pereira A，et al..The impacton biosafety of the phosphinothricin-tolerance transgene in inter-specific B.rapa×B.napus hybrids and their successive backcrosses.TheorAppl Genet，1997，95442-450)；Zhu等(2004)研究9个转GFP-Bt基因甘蓝型油菜品系与三个野生白菜材料杂交、回交后代转基因遗传行为，也发现有2个转基因品系的外源基因在甘白杂种的回交后代中快速丢失(Zhu B，John R.LAWRENCE，Suzanne I.WARWICK et al..Inheritance of GFP-Bttransgenes from Brassica napus in backcrosses with three wild B.rapa accessions.Environ.Biosafety Res.2004，345-54)。上述研究结果都推测是由于外源基因插入甘蓝型油菜C染色体上所形成，表明甘蓝型油菜C染色体转基因品系基因扩散的生态风险小。目前，所有的转基因方法(如基因枪介导法、农杆菌介导法、花粉管通道法等)都不能准确地将外源目标基因转到甘蓝型油菜特定染色体上，现有的转基因方法转基因时，外源基因向受体油菜基因组(染色体组)整合是随机的，目前还没有快速有效的方法鉴定外源基因是转到A染色体上还是转到C染色体上。应用现有的转基因方法，要想获得目标基因准确插入C染色体上的转基因甘蓝型油菜难度很大。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种甘蓝型油菜C染色体组定向转基因的方法，以便外源基因准确无误地定向插入甘蓝型油菜C染色体，获得C染色体转基因甘蓝型油菜。该方法解决如何将外源基因准确插入甘蓝型油菜特定染色体组上的技术难题，可使100％的转基因油菜株系的目标基因插在特定的C染色体组上。根据本专利技术提供的转基因方法并使用本专利技术提供的方法可本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甘蓝型油菜Ｃ染色体组定向转基因的方法，该方法包括下列步骤： Ａ、甘蓝农杆菌介导的遗传转化：首先是农杆菌菌液制备，将含有ｂａｒ基因表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ３３００质粒的农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４划线接种于附加５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＹＥＢ平板培养基上，在２８℃培养箱中倒置培养２－３天，待菌落长出后，从ＹＥＢ平板上挑取一个单菌落，接种于５ｍｌ ＹＥＢ液体培养基中，置摇床上，培养过夜，取菌液划线接种于附加５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＹＥＢ平板上，在２８℃培养箱中倒置培养２天，见菌落长出后，将培养皿至于４℃冰箱备用，在甘蓝转基因实验时，取一个单菌落接种于附加５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＹＥＢ平板培养基上，２８℃培养１－２天，用１／２浓度的ＭＳ液体培养基洗下菌体，并将菌液稀释至ＯＤ↓［６００］＝０．０８；其次是外植体制备，将甘蓝种子消毒，植入１／２浓度ＭＳ培养基上生长４－５天，２５℃、光１６小时／暗８小时，切下叶柄长１－２ｍｍ的子叶和长０．５－０．７ｃｍ的下胚轴分别作为具柄子叶和下胚轴外植体；第三是遗传转化，将外植体置于农杆菌菌液中，２２℃侵染５－１０分钟，其间摇动，在无菌吸水纸上吸干菌液，转至培养基ＭＳ＋１ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．２ｍｇ／Ｌ ６－苄氨基嘌呤上，２２℃暗培养２－３天，然后转到培养基ＭＳ＋４．５ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ↓［３］＋５００ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素上延迟培养５－７天，再转到筛选培养基ＭＳ＋４．５ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ↓［３］＋５００ｍｇ／Ｌ Ｃｂ＋１０ｍｇ／Ｌ草胺膦上培养３－４周，每２周转接一次，待再生绿苗长至１－２ｃｍ时，切下绿苗，植入生根培养基上，待形成植株时，经炼苗移栽花盆中遮荫保湿培养；第四是除草剂抗性检测，Ｔ↓［０］代转基因植株５－６片真叶期用１３．５％的Ｂａｓｔａ↑［＊］１∶２００倍稀释液喷施，转基因阳性植株对该除草剂没有反应，表现除草剂抗性，转基因阴性植株在喷药５天后死亡；第五是ＰＣＲ分子检测，为避免Ｔ↓［０］代转基因植株的假阳性和农杆菌ＬＢＡ４４０４污染，选取用草胺膦筛选呈阳性的Ｔ↓［０］代株系植株进行剥蕾自交，获得Ｔ↓［１］代种子，将Ｔ↓［１］代种子种在网室，苗期用１３．５％的Ｂａｓｔａ↑［＊］１∶２００倍稀释液喷施，取抗性转基因甘蓝和非转基因甘蓝植株的幼嫩叶片，采用ＣＴＡＢ法提取植物基因组ＤＮＡ，然后用２０ｕｌ反应体系对目的基因进行ＰＣＲ扩...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方小平，李均，王转，罗莉霞，李俊，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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