基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法技术

本发明专利技术提供一种基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法，过程如下：选用荧光蛋白对、细胞骨架蛋白、启动子构建表皮可变色的荧光蛋白的重组转座载体；所述荧光蛋白对包括蓝色荧光蛋白和绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白和橙色荧光蛋白、金色荧光蛋白和樱桃红色荧光蛋白；将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；筛选并鉴定出能够稳定表达表皮可变色的鱼种，以获得在光诱导下细胞结构张力变化引起表皮可变色的荧光鱼。本发明专利技术基于荧光能量共振转移技术和基因克隆技术获得的荧光鱼的表皮在光诱导下、在饱、饿状态下改变荧光颜色来增加人鱼互动，提高趣味性，极大地扩增观赏鱼市场的格局。

The production method of fluorescent fish based on the change of cell structure tension

The production method, the invention provides a fluorescent fish cell structure changes of epidermal tension based on color changing process is as follows: selection of recombinant transposon vector fluorescent protein based fluorescent protein epidermal discoloration, cytoskeletal protein, promoter; the fluorescent protein of blue fluorescent protein and green fluorescent protein, green fluorescent protein and the golden orange fluorescent protein, fluorescent protein and cherry red fluorescent protein; recombinant single cell stage fertilized eggs and Tol2mRNA transposon vector was injected into the treated fish, achieving the purpose of gene integration into the genome; screening and identification of a stable expression of epidermal color species, in order to obtain light induced changes in cell the structure of tension caused by fluorescent fish skin discoloration. Based on fluorescence energy resonance transfer technology and gene cloning technology, the fluorescent skin of the fish can be changed under the light induced, full and hungry state to change the fluorescence color to increase the interaction of the mermaid and improve the interest, and greatly enlarge the pattern of the ornamental fish market.

【技术实现步骤摘要】
基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法
本专利技术涉及基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法，具体涉及一种运用荧光能量共振转移技术和基因克隆技术生产基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的方法。
技术介绍
作为一种观赏性物种，观赏鱼在全球的范围内一直拥有着广泛的市场，而荧光鱼因为具有色彩亮丽、在光线较弱或者不能进行大范围光照的情况下具有令人惊奇的装饰和欣赏效果。因此荧光鱼的出现极大的改变了观赏鱼市场的格局。目前由于转基因技术的成熟，获得具有特定性状的鱼的方式已经由原本通过传统杂交技术引起的缓慢改变变成了在较短的时间内便可以获得具有特定性状的鱼。因此，通过转基因技术获得荧光观赏鱼的方式已经取得了巨大的商业价值。现有技术中已有多种将外源基因转入鱼中的技术，包括微注射、病毒介导的基因整合基因重组、基因敲除、以及转座子等技术。目前，市场上已经出现了一些利用转基因技术构建的荧光观赏鱼，如台湾邰港公司在鱼内基因组中转入荧光蛋白连接启动子，从而获得了多个观赏鱼种；新加坡国立大学将四种特异性的启动子连接单一荧光，在荧光鱼的特定部位表达荧光基团。美国YorktownTechnology公司也通过特异性启动子驱动蓝色蛋白在鱼体内的表达。但现有的荧光观赏鱼(例如CN1590548A、CN1647625A、US7135613、US7700825、US8232450、等)均存在以下弊端。首先，现有技术实现的均是对荧光蛋白的组织的特异性表达，即仅在鱼的特定组织出现荧光，由此缺乏一定的观赏性。其次，实现的均是单色荧光的表达，即不能在外界的刺激下改变颜色，由此缺乏一定的互动性或趣味性。此外，由于一些鱼体自身体表色素沉淀较多，导致鱼体表面透明度较低，从而屏蔽了激发光对荧光基团的激发，导致荧光基团发光效率低，使得荧光较为暗淡，从而进一步降低了观赏性。最重要的是，上述专利为了在一定程度上挽救这个缺点，选择使用很强的启动子来驱动荧光基团的表达这一方法，而忽视了这些荧光基团的光毒性对鱼造成的危害，不仅使得鱼的寿命大大缩短，也容易对环境进行污染。此外，现有技术中所获得的荧光鱼均未实现绝育化，这样的转基因鱼种一旦进入自然环境，可能对自然界造成强烈的基因污染。荧光共振能量转移(FRET)，也叫非辐射能量转移，是1948年由Foster采用荧光染料创立的理论原理。具体指当供体(D)和受体(A)两荧光活性基团相距很近(几个原子直径范围)，且供体发射荧光与受体发色基团吸收光谱重叠时，用适当频率的光激发供体，产生的振荡偶极子能与受体偶极子发生共振，最终荧光能量从供体向受体转移，诱导受体发射荧光的现象叫做FRET。通过检测两个荧光“发光光谱与激发光谱”重叠的“发色基团”能量转移的效率，能评价发色基团的距离变化，成为一种高效的光学“纳米分子尺”。FRET诱导的能量转移效率不仅取决于荧光基团的距离，也与光谱特性及相对取向(角度)密切相关。该技术的建立和应用，取得的研究成果已在PNAS、AntioxidRedoxSignal和JCellSci等期刊发表。鉴于当前国际生物物理社会的日益认可和接受，开发商业化的力学检测探针，推广其医药研发应用，很可能成为继化学、电信号后又一新兴科技领域。通过基因克隆、转染和表达将荧光张力插入细胞结构蛋白内或蛋白之间，使骨架结构传递的力学变化转化为光学信号，能明显弥补现有细胞力学检测技术的缺陷。研发一种基于荧光能量共振转移技术和基因克隆技术生产表皮可变色的荧光鱼的方法，有效克服现有技术中无法实现多色荧光表达的不足，具有一定的意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法，其基于荧光能量共振转移技术和基因克隆技术获得的荧光观赏鱼的表皮在光诱导下、在饱、饿状态下可改变荧光颜色来增加人鱼互动，提高趣味性，极大地扩增观赏鱼市场的格局。一方面，本专利技术提供一种基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法，具体步骤如下：步骤一：选用荧光蛋白对、细胞骨架蛋白、启动子构建表皮可变色的荧光蛋白的重组转座载体；所述荧光蛋白对包括蓝色荧光蛋白(eBFP2)和绿色荧光蛋白(eGFP)、青色荧光蛋白(eCFP)和橙色荧光蛋白(eYFP)、金色荧光蛋白(venus)和樱桃红色荧光蛋白(mcherry)；步骤二：将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；步骤三：筛选并鉴定出能够稳定表达表皮可变色的荧光蛋白的鱼种，以获得在光诱导下细胞结构张力变化引起表皮可变色的荧光鱼。进一步地，所述细胞骨架蛋白包括细胞微丝骨架或中间纤维骨架；优选地，所述细胞骨架蛋白为β-actin、α-tubulin、β-tubulin、vimentin、LaminA/C、LaminB1或LaminB2。进一步地，所述荧光蛋白对为青色荧光蛋白(eCFP)和橙色荧光蛋白(eYFP)。进一步地，所述启动子为鱼种以及其他水生物品种的全发育时期的表皮特异表达的启动子，优选为CMVIE真核启动子。进一步地，所述重组转座载体的构建方法，具体过程如下：1)将荧光蛋白、细胞骨架蛋白分别进行PCR扩增并酶切；2)将载体、启动子分别进行酶切；3)步骤1)和步骤2)酶切片段混匀后进行多段连接形成重组转座载体。进一步地，所述载体为miniTol2。进一步地，所述重组转座载体为CMVIE真核启动子-β-actin-eCFP-7aa-eYFP-β-actin-miniTol2，其序列结构如SEQIDNO:1所示。进一步地，步骤C获得表皮可变色的荧光鱼后还需进一步进行筛选得到纯合体F3，具体步骤如下：将步骤C获得的表皮可变色的荧光鱼与野生型鱼进行杂交，产生所述表皮可变色的荧光鱼的杂合体F1，从杂合体F1中筛选出表皮表达可变色荧光蛋白的杂合体F1；选取单个表皮表达可变色荧光蛋白的杂合体F1与野生型鱼进行杂交产生所述表皮可变色的荧光鱼的杂合体F2，从杂合体F2中筛选出表皮表达可变色荧光蛋白的雌鱼和雄鱼；将筛选的雌鱼和雄鱼进行交配得到表皮可变色的荧光鱼的纯合体F3，从纯合体F3中筛选出含有表皮可变色荧光蛋白的纯合表皮可变色的荧光鱼。进一步地，本专利技术的基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法还包括如下绝育步骤：通过温度物理绝育处理法、静水压物理绝育处理法、电休克物理绝育处理法、细胞松弛素B化学绝育处理法、秋水仙素化学绝育处理法、聚乙二醇化学绝育处理法、或6-二甲基氨基嘌呤化学绝育处理法对所述纯合表皮可变色的荧光鱼的单细胞期受精卵进行处理，以获得所述纯合表皮可变色的荧光鱼的四倍体；将所述纯合表皮可变色的荧光鱼的二倍体和所述纯合表皮可变色的荧光鱼的四倍体进行杂交，以获得所述纯合表皮可变色的荧光鱼的绝育的三倍体。更进一步地，所述温度物理绝育处理法包括：将所述纯合表皮可变色的荧光鱼纯合体的单细胞期受精卵置于42℃的养鱼水中，热激10分钟。进一步地，本专利技术的基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法还包括如下色素基因敲除步骤之一：在所述步骤A之前，通过基因敲除技术对所述待处理鱼种进行处理，敲除其中的鱼体色素基因；或者在获得所述表皮可变色的荧光鱼之后，通过基因敲除技术对所述表皮可变本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一：选用荧光蛋白对、细胞骨架蛋白、启动子构建表皮可变色的荧光蛋白的重组转座载体；所述荧光蛋白对包括蓝色荧光蛋白和绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白和橙色荧光蛋白、金色荧光蛋白和樱桃红色荧光蛋白；步骤二：将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；步骤三：筛选并鉴定出能够稳定表达表皮可变色的荧光蛋白的鱼种，以获得在光诱导下细胞结构张力变化引起表皮可变色的荧光鱼。

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一：选用荧光蛋白对、细胞骨架蛋白、启动子构建表皮可变色的荧光蛋白的重组转座载体；所述荧光蛋白对包括蓝色荧光蛋白和绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白和橙色荧光蛋白、金色荧光蛋白和樱桃红色荧光蛋白；步骤二：将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；步骤三：筛选并鉴定出能够稳定表达表皮可变色的荧光蛋白的鱼种，以获得在光诱导下细胞结构张力变化引起表皮可变色的荧光鱼。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞骨架蛋白为β-actin、α-tubulin、β-tubulin、vimentin、LaminA/C、LaminB1或LaminB2；所述启动子为鱼种的全发育时期的表皮特异表达的启动子。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组转座载体的构建过程如下：1)将荧光蛋白、细胞骨架蛋白分别进行PCR扩增并酶切；2)将载体、启动子分别进行酶切；3)步骤1)和步骤2)酶切片段混匀后进行多段连接形成重组转座载体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组转座载体为CMVIE真核启动子-β-actin-eCFP-7aa-eYFP-β-actin-miniTol2，其序列结构如SEQIDNO:1所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C获得表皮可变色的荧光鱼后还需进一步进行筛选得到纯合体F3，具体步骤如下：将步骤C获得的表皮可变色的荧光鱼与野生型鱼进行杂交，产生所述表皮可变色的荧光鱼的杂合体F1，从杂合体F1中筛选出表皮表达可变色荧光蛋白的杂合体F1；选取单个表皮表达可变色荧光蛋白的杂合体F1与野生型鱼进行杂交产生所述表皮可变色的荧光鱼的杂合体F2，从杂合体F2中筛选出表皮表达可变色荧光蛋白的雌鱼和雄鱼；将筛选的雌鱼和雄鱼进行交配得到表皮可变色的荧光鱼的纯合体F3，从纯合体F3中筛选出含有表皮可变色荧光蛋白的纯合表皮可变色的荧光鱼。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雨轩，郭军，生茂正，孔敏，马佳蕊，邱珂，蔡雨婷，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32