莱茵衣藻KCN4基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了莱茵衣藻

Application of KCN4 gene in the regulation of Rhine Rhine Chlamydomonas reinhardtii in cadmium tolerance

The present invention discloses Rhine Chlamydomonas

【技术实现步骤摘要】
莱茵衣藻KCN4基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用
本专利技术涉及生物
与环境污染治理领域，具体涉及莱茵衣藻KCN4基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。
技术介绍
工业废水中有一类为含镉废水，镉污染是一类严重影响环境的污染，一个电池中的镉能够污染60万升水，所以对镉污染水环境的预防是至关重要的。莱茵衣藻是地球上最古老的生物之一，它是一种单细胞真核生物，易于培养和收集，莱茵衣藻21gr本身对一定浓度的氯化镉具有抗性，而本专利技术获得的突变体对相同浓度氯化镉极其敏感，不能正常生活在此环境中，通过敏感型莱茵衣藻突变体检测环境中的镉污染成本小，无二次污染。本专利技术利用插入突变的方法获得了对重金属镉敏感的突变藻株，经鉴定得到了对衣藻镉耐受性调控相关的KCN4(Voltage-gatedK+channel)基因及其编码蛋白，钾离子通道结构由四条蛋白质次单位聚集而成，其中心有一个离子引导空洞的开合以此来运输各种离子，由于电压控门钾离子通道基因突变从而其结构的改变，导致该突变体在0.4mM的镉离子浓度环境下不能正常生长。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供莱茵衣藻KCN4基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于KCN4基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本专利技术的目的还在于提供莱茵衣藻KCN4基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉敏感型藻株的获得方法以及镉敏感型藻株的应用等。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段随机插入衣藻中得到了对镉显著敏感的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的镉敏感性是由于aphⅧ片段插入到KCN4(Voltage-gatedK+channel)基因第4个内含子中造成的。KCN4基因在JGI莱茵衣藻基因数据库中的基因编号是Cre02.g144950，位于莱茵衣藻第2号染色体的7362491-7370810区域，其CDS序列如SEQIDNO:1所示。基于上述发现，本专利技术的目的之一是提供莱茵衣藻KCN4基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。所述KCN4基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：(1)包含如SEQIDNO:1所示3132bp的核苷酸序列；(2)包含编码SEQIDNO:2所示蛋白质的核苷酸序列；(3)包含与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述KCN4基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：(1)包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列；(2)包含由SEQIDNO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQIDNO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。本专利技术的目的之二是提供上述莱茵衣藻KCN4基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻KCN4基因的表达、使KCN4基因失活或缺失KCN4基因来降低莱茵衣藻对镉的耐受性。本专利技术的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻KCN4基因降低莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻KCN4基因的表达、使KCN4基因失活或缺失KCN4基因来降低莱茵衣藻对镉的耐受性。本专利技术的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉敏感型藻株。所述镉敏感型藻株为不含KCN4基因活性的KCN4基因突变株或KCN4基因缺失株，或KCN4基因表达下降的KCN4基因表达缺陷株。本专利技术的目的之五是提供一种莱茵衣藻敏感型藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻KCN4基因突变株，通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻KCN4基因缺失株，通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻KCN4基因表达缺陷株。本专利技术的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉敏感型藻株在重金属镉污染的监测、检测中的应用。根据莱茵衣藻的KCN4基因表达缺陷株、KCN4基因突变株或KCN4基因缺失株对重金属镉的敏感性，只能在较低浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测和检测中，尤其可应用于污水中镉的监测和检测中，如所述莱茵衣藻镉敏感型藻株可以监测环境水体中的镉含量是否超标，方便检测环境中镉污染程度并起到预防或者改善环境镉污染。所述莱茵衣藻镉敏感型藻株应用于监控或者检测环境水体中重金属镉污染的状况，为水体中重金属镉的检测、以及生物法处理污水提供一种新的思路与新的材料。同时，研究KCN4基因在衣藻重金属镉代谢调控网络中的作用机制，可进一步为生物法治理污水提供理论基础。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术通过电击转化法将aphⅧ片段导入衣藻中，通过筛选获得对镉敏感的突变体藻株，技术体系成熟、方法简单、效率高。(2)本专利技术通过RESDA-PCR技术鉴定出突变体突变基因及插入突变位点，可用于研究衣藻重金属镉代谢机制。(3)本专利技术通过0.4mM氯化镉筛选敏感型突变体，0.4mM氯化镉的筛选浓度为前期实验获得的最佳敏感型突变体筛选浓度，并通过3-5次反复复筛得到对镉敏感的突变体藻株，性状稳定且用时短。(4)本专利技术所得到的KCN4基因突变藻株可用于水环境中镉污染的检测和监控，为生物法污水治理提供一种新的材料。附图说明图1为pJMG-aphⅧ质粒EcoRI酶切后琼脂糖凝胶电泳图。图2为野生型莱茵衣藻21gr和镉敏感型衣藻突变体(kcn4)经0.4mM氯化镉筛选的对照图。图3为镉敏感型衣藻突变体(kcn4)经RESDA-PCR后琼脂糖凝胶电泳图。图4为镉敏感型衣藻突变体(kcn4)的突变基因KCN4的插入突变位点示意图。具体实施方式为了让该领域或者相关人员能够更好的了解这个专利技术，下面结合以下几个实施例进行说明，这些方法只是为了更好的阐述该专利技术，并不限制本专利技术。以下实施例中，没有特殊说明的均为常规方法。下述实施例中所用培养基配方如下：TAP培养基配方：Tris1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、SolutionⅡ(磷酸盐)0.188mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。固体培养基则加入7.5gAgar(琼脂)。TAgP培养基配方：Tris1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、甘油磷酸钠(1M)0.376mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。若要配制固体培养基则加入7.5gAgar(琼脂)。实施例1：通过电转化法得到莱茵衣藻转化子(1)从-80℃中取出含pJMG-aphⅧ(ZhangfengHu,YinwenLiang,WeiHe,JunminPan*,CiliaDisassemblywithTwoDistinctPhasesofRegulation,CellReports,2015,10(11):1803-1810)的菌液200μL于50mL含有10mL加有氨苄抗生素的LB培养基的离心管中(离心管经过高压蒸汽灭菌处理)，37℃、200rpm摇菌8h。(2)采用生工公司质粒提取试剂盒(货号为B518191-0100)提取质粒，采用EcoRⅠ-HiFi酶和cutsmartbuffer进行酶切反应，37℃酶切过夜后，通过1％琼脂糖凝胶电泳得到aphⅧ片段(序列SEQIDNO:3所示)，大小本文档来自技高网...

【技术保护点】
莱茵衣藻

【技术特征摘要】
1.莱茵衣藻KCN4基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：所述KCN4基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：（1）包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；（2）包含编码SEQIDNO:2所示蛋白质的核苷酸序列；（3）包含与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述KCN4基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：（1）包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列；（2）包含由SEQIDNO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQIDNO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。3.莱茵衣藻KCN4基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：通过降低莱茵衣藻KCN4基因的表达、使KCN4基因失活或缺失KCN4基因来降低莱茵衣藻对镉...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡长峰，胡潇，章伟雄，李丽丽，康研，李论，田广梅，陈斌，周俊飞，陈利红，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42