莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了莱茵衣藻

Application of TIC20 gene in the regulation of Rhine Rhine Chlamydomonas reinhardtii in cadmium tolerance

The present invention discloses Rhine Chlamydomonas

【技术实现步骤摘要】
莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用
本专利技术涉及生物
与环境污染治理领域，具体涉及莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。
技术介绍
随着科技的飞速发展，我国的工业化程度不断提高，随之而来的一系列环境问题逐渐被人们所重视。由于不科学，不环保的工业发展，导致了一系列的环境污染，其中大气污染和水环境污染尤为严重，而这其中的污染就包括镉污染。镉污染属于重金属污染，镉的来源很广泛，废弃电池、汽车废气、重工业废水中都含有镉，其中废弃电池会造成土壤镉污染，汽车尾气会造成大气镉污染，而重工业排放的废水会造成水环境废污染。因此，如何对环境中的重金属镉进行监控和富集回收已经成为了研究的热点问题。莱茵衣藻是一种单细胞真核生物，能够在水体环境和土壤中生长，利用衣藻的这种生物特性可以很容易的检测水体环境和土壤中的重金属镉。衣藻培养条件简单，所以相比于物理化学法来检测和治理重金属镉污染，生物法更为简单且成本低，利用微生物来检测和治理重金属镉被得到广泛的关注，包括细菌和藻类，利用这类微生物体积小，容易培养等特性，可以将微生物置于重金属环境中，利用微生物的代谢检测环境中的重金属。野生型的莱茵衣藻对镉具有一定的吸附作用，而一些突变体对镉敏感，与野生型的莱茵衣藻相比，这些突变体在相同的条件下对镉的吸附能力更弱或是对镉没有吸附能力。莱茵衣藻突变体的筛选体系简单，培养方便，莱茵衣藻的基因组已经全部测序成功，这对其基因和编码蛋白的研究更加方便。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于TIC20基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本专利技术的目的还在于提供莱茵衣藻TIC20基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉敏感型藻株的获得方法以及镉敏感型藻株的应用等。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段随机插入衣藻中得到了对镉显著敏感的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的镉敏感性是由于aphⅧ片段插入到TIC20基因的3’UTR中造成的。TIC20基因在JGI莱茵衣藻基因数据库中的基因编号是Cre08.g379650，位于莱茵衣藻第8号染色体的4105757-4109255区域，其CDS序列如SEQIDNO:1所示。基于上述发现，本专利技术的目的之一是提供莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。所述TIC20基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：(1)包含如SEQIDNO:1所示780bp的核苷酸序列；(2)包含编码SEQIDNO:2所示蛋白质的核苷酸序列；(3)包含与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述TIC20基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：(1)包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列；(2)包含由SEQIDNO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQIDNO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。本专利技术的目的之二是提供上述莱茵衣藻TIC20基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻TIC20基因的表达、使TIC20基因失活或缺失TIC20基因来降低莱茵衣藻镉耐受性。本专利技术的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻TIC20基因降低莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻TIC20基因的表达、使TIC20基因失活或缺失TIC20基因来降低莱茵衣藻镉耐受性。本专利技术的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉敏感型藻株。所述镉敏感型藻株为不含TIC20基因活性的TIC20基因突变株或TIC20基因缺失株，或TIC20基因表达下降的TIC20基因表达缺陷株。本专利技术的目的之五是提供一种莱茵衣藻敏感型藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻TIC20基因突变株，通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻TIC20基因缺失株，通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻TIC20基因表达缺陷株。本专利技术的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉敏感型藻株在重金属镉污染的监测与检测的应用。根据莱茵衣藻的TIC20基因表达缺陷株、TIC20基因突变株或TIC20基因缺失株对重金属镉的敏感性，只能在较低浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测和检测中，尤其可应用于污水中镉的监测和检测中，如所述莱茵衣藻镉敏感型藻株可以监测环境水体中的镉含量是否超标，方便检测环境中镉污染程度并起到预防或者改善环境镉污染。所述莱茵衣藻镉敏感型藻株应用于监控或者检测环境水体中重金属镉污染的状况，为水体中重金属镉的检测、以及生物法处理污水提供一种新的思路与新的材料。同时，研究TIC20基因在衣藻重金属镉代谢调控网络中的作用机制，可进一步为生物法治理污水提供理论基础。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术通过电击转化法将aphⅧ片段导入衣藻中，通过抗生素筛选得到对镉敏感的突变体藻株(tic20)方法简单，效率高。(2)本专利技术通过RESDA-PCR技术鉴定出突变体突变基因TIC20及插入突变位点，用于研究衣藻重金属代谢机制。(3)本专利技术通过0.4mM氯化镉筛选，并通过含0.4mM氯化镉固体培养基多次复筛得到对镉敏感的突变体藻株的方法可行且获得的突变体性状稳定。(4)本专利技术所得到的镉敏感型藻株可用于水环境中镉污染的检测和监控，将藻株吸附在专门的材料载体上不会造成二次污染、便于回收。附图说明图1为pJMG-aphⅧ质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图。图2为野生型莱茵衣藻21gr和镉敏感型衣藻突变体(tic20)经0.4mM氯化镉筛选的生长对照图。图3为镉敏感型衣藻突变体(tic20)经RESDA-PCR后琼脂糖凝胶电泳图。图4为镉敏感型衣藻突变体(tic20)中TIC20基因的插入突变位点示意图。具体实施方式为了让该领域或者相关人员能够更好的了解这个专利技术，下面结合以下几个实施例进行说明，这些方法只是为了更好的阐述该专利技术，并不限制本专利技术。以下实施例中，没有特殊说明的均为常规方法。下述实施例中所用培养基配方如下：TAP培养基配方：Tris1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、SolutionⅡ(磷酸盐)0.188mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。固体培养基则加入7.5gAgar(琼脂)。TAgP培养基配方：Tris1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、甘油磷酸钠(1M)0.376mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。若要配制固体培养基则加入7.5gAgar(琼脂)。实施例1：通过电转化法得到莱茵衣藻转化子(1)将野生型莱茵衣藻(21gr)从固体TAP培养基上转接至高压蒸汽灭菌过的TAP液体培养基中，连续光周期下吹气培养至细胞浓度为1×107细胞/mL(此过程大约需要三天),将在光周期下培养浓度至1×107细胞/mL的细胞转接至含有TAP液体培养基的摇瓶中(摇瓶经过高压蒸汽灭菌)使细胞初始浓度为1×106细胞/mL，在连续光周期和摇床转速为200rp本文档来自技高网...

【技术保护点】
莱茵衣藻

【技术特征摘要】
1.莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：所述TIC20基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：（1）包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；（2）包含编码SEQIDNO:2所示蛋白质的核苷酸序列；（3）包含与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TIC20基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：（1）包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列；（2）包含由SEQIDNO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQIDNO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。3.莱茵衣藻TIC20基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：通过降低莱茵衣藻TIC20基因的表达、使TIC20基因失活或缺失TIC20基因来降低莱茵衣藻镉耐受...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡长峰，胡潇，章伟雄，彭海，陈斌，刘艳玲，王露，丁梅，刘致浩，李甜甜，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42