莱茵衣藻TRIP12基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了莱茵衣藻

Application of TRIP12 gene in the regulation of Rhine Rhine Chlamydomonas reinhardtii in cadmium tolerance

The present invention discloses Rhine Chlamydomonas

【技术实现步骤摘要】
莱茵衣藻TRIP12基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用
本专利技术涉及生物
和环境污染治理领域，具体涉及莱茵衣藻TRIP12基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。
技术介绍
近年来，随着环境的恶化，水体的污染，人们的生活质量不能得以保障。其中，工厂排放的污水和土壤中含有较多的重金属，这些重金属最容易通过食物和饮用水进入到人体内，土壤中的重金属会附着人们种植的水稻和玉米等农作物中，被人们食用后会在人体内由无机镉转化成有机镉，造成人体的重金属中毒，人体重金属中毒后，体内的细胞不能正常工作，损害人体的健康。因此，应该及时预防和治理重金属污染。传统的治理镉污染的方法有物理化学法和生物法，其中物理化学法主要为化学沉淀法、离子交换法、高分子捕集剂法、活性炭吸附法、膜分离、溶剂萃取法等，而生物法主要为生物吸附法、植物修复法等。其中物理化学法主要是利用物理材料和化学试剂对重金属进行吸附，成本高且容易造成二次污染，而生物法主要是吸附重金属，通过生物代谢重金属，不会造成二次污染，而且成本较低。微生物体积微小易繁殖，并且可以吸附不同种类的重金属。其中藻类更是被广泛用于重金属的治理，莱茵衣藻、小球藻、马尾藻和螺旋藻等藻类对重金属都有一定的吸附能力。利用莱茵衣藻对重金属镉有一定的吸附性，我们通过插入突变的方法得到对镉有一定抗性的突变体，以此来预防和治理环境中的镉污染。莱茵衣藻是一类单细胞真核生物，其基因组测序已经完成，我们容易得到突变体的突变基因，因此便于研究其对镉抗性的机理。本专利技术利用插入突变的方法获得了对重金属镉具有明显抗性的突变藻株，经鉴定得到了对衣藻镉代谢调控相关的基因TRIP12及其编码蛋白，TRIP12基因编码蛋白是一类人类HECT结构的E3泛素化连接酶蛋白。本专利技术得到的TRIP12基因突变藻株，可用来研究莱茵衣藻重金属镉的代谢机理和TRIP12在基因在调控衣藻重金属镉代谢中的作用机制，以及用于镉污染的监控与治理。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供莱茵衣藻TRIP12基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于TRIP12基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本专利技术的目的还在于提供莱茵衣藻TRIP12基因在提高莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉耐受性增强藻株的获得方法以及镉耐受性增强藻株的应用等。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段随机插入衣藻中得到了明显抗氯化镉的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的抗镉性是由于aphⅧ片段插入到TRIP12基因的第8个内含子中造成的，该基因在JGI莱茵衣藻基因数据库中的基因编号是Cre07.g312900，定位于衣藻7号染色体的103126-112807区域其CDS序列如SEQIDNO:1所示。基于上述发现，本专利技术的目的之一是提供莱茵衣藻TRIP12基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。所述TRIP12基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：(1)包含如SEQIDNO:1所示6330bp的核苷酸序列；(2)包含编码SEQIDNO:2所示蛋白质的核苷酸序列；(3)包含与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述TRIP12基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：(1)包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列；(2)包含由SEQIDNO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQIDNO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。所述TRIP12基因的编码蛋白是一类HECT结构E3泛素化连接酶蛋白。本专利技术的目的之二是提供上述莱茵衣藻TRIP12基因在提高莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻TRIP12基因的表达、使TRIP12基因失活或缺失TRIP12基因提高莱茵衣藻镉耐受性。本专利技术的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻TRIP12基因提高莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻TRIP12基因的表达、使TRIP12基因失活或缺失TRIP12基因提高莱茵衣藻镉耐受性。本专利技术的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉耐受性增强藻株。所述镉耐受性增强藻株为不含TRIP12基因活性的TRIP12基因突变株或TRIP12基因缺失株，或TRIP12基因表达下降的TRIP12基因表达缺陷株。本专利技术的目的之五是提供一种莱茵衣藻镉耐受性增强藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻TRIP12基因突变株，通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻TRIP12基因缺失株，通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻TRIP12基因表达缺陷株。本专利技术的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉耐受性增强藻株在重金属镉污染的监测、检测与治理中的应用。根据莱茵衣藻的TRIP12基因表达缺陷株、TRIP12基因突变株或TRIP12基因缺失株可以在较高浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测、检测和治理中，尤其可应用于污水中镉的监测、检测和治理中，为生物法污水处理提供一种的新的思路与新的材料。同时，进一步研究TRIP12基因在衣藻重金属镉耐受性调控的具体作用机制，能够为利用衣藻进行重金属污水处理奠定理论基础。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术通过电击转化法将aphⅧ片段导入衣藻中，通过抗性筛选得到对镉有一定抗性的突变体藻株，方法简单，效率高。(2)本专利技术通过RESDA-PCR技术鉴定出筛选到的抗氯化镉突变体的突变基因为TRIP12，并且为aphⅧ反向插入到该基因的第八个内含子中形成的插入突变，可以进一步研究TRIP12基因在莱茵衣藻中调控镉耐受性的作用机理。(3)本专利技术中使用的0.6mM氯化镉筛选浓度为前期反复试验获得，为筛选氯化镉抗型衣藻突变体的最佳浓度。通过在含0.6mM氯化镉固体培养基上进行多次复筛获得对镉有抗性的突变体藻株，方法简单、用时短、效果好、获得的突变体性状稳定。(4)利用本专利技术所发现的TRIP12基因的功能，可以获得对氯化镉具有一定抗性的TRIP12基因突变体或者功能缺陷藻株，可用于水域中重金属镉的检测以及含重金属镉的污水处理中。通过突变体藻株富集重金属镉，代谢消化后收集突变体藻株，不会对环境造成二次污染，方法可行，成本低。附图说明图1为pJMG-aphⅧ质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图。图2为野生型莱茵衣藻(21gr)和抗氯化镉型莱茵衣藻突变体(trip12)经0.6mM氯化镉筛选的生长对照图。图3为氯化镉抗型莱茵衣藻突变体经RESDA-PCR后琼脂糖凝胶电泳图。图4为氯化镉抗型衣藻突变体中插入突变基因TRIP12的具体插入突变位点示意图。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用培养基配方如下：TAP培养基配方：Tris1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、SolutionⅡ(磷酸盐)0.188mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。固体培养基则加入7.5gAgar(琼脂)。TAgP培养基配方：Tris1.21g、SolutionI(盐溶液)1本文档来自技高网...

【技术保护点】
莱茵衣藻

【技术特征摘要】
1.莱茵衣藻TRIP12基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：所述TRIP12基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：（1）包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；（2）包含编码SEQIDNO:2所示蛋白质的核苷酸序列；（3）包含与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TRIP12基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：（1）包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列；（2）包含由SEQIDNO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQIDNO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。3.莱茵衣藻TRIP12基因在提高莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：通过降低莱茵衣藻TRIP12基因的表达、使TRIP12基因失活或缺失TRIP12基因提高莱茵衣藻镉耐受性。4.一种提高莱茵衣藻镉耐受性的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡长峰，胡潇，章伟雄，高利芬，彭海，田广梅，刘艳玲，殷正伟，曾诗乐，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42