一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法，属于生物技术和人体运动技术领域。其包括如下步骤：步骤1：细胞培养；步骤2：电脉冲刺激；步骤3：模型的建立。本发明专利技术发现了电脉冲刺激诱导成肌细胞收缩,进而诱发乳酸分泌增多的现象，同时建立了4天电脉冲刺激小鼠成肌细胞且在电脉冲刺激后36h能够诱发细胞中甘油三酯堆积模型，从而得出无氧代谢糖酵解产物乳酸在运动训练诱导骨骼肌细胞脂滴堆积和线粒体功能蛋白增加方面承担重要角色。本发明专利技术所述建立的方法可以更好的模拟长期耐力训练对骨骼肌细胞能源物质和功能的影响。

A method for establishing a model of lactic acid and triglyceride accumulation in skeletal muscle cells induced by motion

The invention discloses a method for establishing a sports induced skeletal muscle cell lactic acid and triglyceride accumulation model, which belongs to the field of biotechnology and human sports technology. It includes the following steps: Step 1: cell culture; step 2: electric pulse stimulation; step 3: model establishment. The present invention found that electric pulse stimulation induced contraction of muscle cell, and then induced lactic acid secretion phenomenon, and set up 4 static pulse stimulation of mouse myoblasts and electrical stimulation after 36h can induce cell triglyceride accumulation model, so that the anaerobic glycolysis play an important role in the solution of exercise induced skeletal lactic acid muscle cells and accumulation of lipid droplets and mitochondrial function of protein increased. The method described in the present invention can better simulate the effect of long-term endurance training on energy material and function of skeletal muscle cells.

【技术实现步骤摘要】
一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法
本专利技术涉及一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法，属于生物技术和人体运动

技术介绍
长时间耐力训练能够增加骨骼肌细胞中甘油三酯含量和线粒体氧化脂肪酸功能，尤其以马拉松运动员表现突出。但是耐力训练增加骨骼肌细胞中甘油三酯含量和线粒体功能的机制还不清楚。运动过程中骨骼肌组织中堆积乳酸，乳酸是否参与了运动训练诱导骨骼肌TG堆积和线粒体功能蛋白增加目前还不清楚。在细胞培养中，电脉冲(EPS)刺激分化成功的骨骼肌细胞能够替代神经电信号激活骨骼肌纤维。目前大部分关于EPS诱导细胞收缩模型能够用于研究训练骨骼肌一些适应性变化。另外，随着老龄化，老年人肌力下降现象增多，同时卧床病人往往出现肌萎缩下降。体外电脉冲方式来改善和恢复骨骼肌功能在临床上使用逐渐增多。但是目前改善肌萎缩和肌力下降的最佳电脉冲参数还不十分清楚。在过去的几年时间内，有关培养的骨骼肌细胞EPS模型的报道越来越多，这表明学者们对建立一种骨骼肌细胞EPS模型表现出浓厚兴趣，这种模型能够用来在体外进一步研究运动引起骨骼肌适应变化的分子机制和探究改善肌萎缩和肌力下降的较佳电脉冲参数。目前这一电脉冲参数较少同时关于EPS诱发骨骼肌细胞乳酸增多和TG堆积模型尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法。本专利技术发现了电脉冲刺激诱导成肌细胞收缩,进而诱发乳酸分泌增多的现象，同时建立了4天电脉冲刺激小鼠成肌细胞且在电脉冲刺激后36h能够诱发细胞中甘油三酯堆积模型，从而得出无氧代谢糖酵解产物乳酸在运动训练诱导骨骼肌细胞脂滴堆积和线粒体功能蛋白增加方面承担重要角色。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法，包括如下步骤：步骤1：细胞培养将小鼠成肌细胞接种于细胞培养基中，培养后，加入消化液，进行细胞消化，然后，将消化后的细胞铺入6孔板，当6孔板中的细胞融合到90-95％时，将细胞培养基更换为细胞分化培养基，每24h更换一次细胞分化培养基，分化4-6天；步骤2：电脉冲刺激实验组：电脉冲刺激每天1次，共持续4天；其中，第1天和第2天：电压14V/10mm，单次脉冲时长2ms，频率1Hz，每天总时长2h；第3天和第4天：电压30V/10mm，单次脉冲时长2ms，频率0.5-10Hz，每天总时长3h；每次电脉冲刺激前1h，每孔更换2-3mL新鲜的细胞分化培养基；在第3天电脉冲刺激后即刻收集细胞，分别测定乳酸和ATP含量；同时在第3天电脉冲刺激后3h收集细胞，分别检测肌球蛋白重链亚型MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIx和MyHCIIb的mRNA含量；分别在第4天电脉冲刺激后12h、24h和36h收集细胞，测定甘油三酯含量；同时，设定对照组，即不进行电脉冲刺激，其余同实验组；步骤3：模型的建立与对照组相比，当步骤2测定的实验组的第3天电脉冲刺激后肌管细胞中乳酸含量显著升高，即独立样本t检验的显著性水平P值<0.05；且第3天电脉冲刺激后肌管细胞中ATP含量显著降低，即独立样本t检验的显著性水平P值<0.05；且第3天电脉冲刺激后肌管细胞中肌球蛋白重链亚型出现显著改变时，即独立样本t检验的显著性水平P值<0.05；且第4天电脉冲刺激后12h、24h和36h的甘油三酯含量增加50％以上，即建立所述运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型。本专利技术的步骤2中，电脉冲电压范围为14V/10mm-30V/10mm，如果电压太小或过大均会出现肌管细胞不收缩问题。采用的频率为0.5Hz-10Hz，如果电脉冲频率过大，容易出现肌管细胞强直收缩，细胞膜和细胞器受损，细胞脱落死亡的问题。电脉冲每次时间为2-3小时，如果电脉冲刺激时间过短，细胞不出现收缩问题。采用4d电脉冲方案诱发脂滴堆积，是考虑细胞收缩后恢复的问题，采用长时间多次电脉冲刺激来诱发脂滴堆积。分化后肌管细胞存活时间有限问题，电脉冲时间过程不利于脂滴堆积。在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。进一步，步骤1所述成肌细胞为C2C12肌管细胞。采用上述进一步方案的有益效果是：上述细胞容易获得，且能够很好的反映电脉冲刺激后骨骼肌细胞产生的变化。进一步，步骤1所述细胞培养基为含有体积百分数10％胎牛血清、体积百分数1％青链霉素的高糖DMEM培养基。其中，高糖DMEM，品牌为HyClone，货号SH30022.01，购自美国犹他州洛根市；10％胎牛血清，品牌Ausvin，货号VS500T，购自澳大利亚；1％青链霉素，货号KGY0023，购自江苏凯基生物技术有限公司。进一步，步骤1所述培养的条件为37℃、5％CO2恒温培养8-10天，所述消化液为0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液。进一步，步骤1和步骤2所述细胞分化培养基均为含有体积百分数2％马血清、体积百分数1％青链霉素的高糖DMEM培养基。其中，高糖DMEM，品牌为HyClone，货号SH30022.01，购自为美国犹他州洛根市；1％青链霉素，货号KGY0023，购自江苏凯基生物技术有限公司。进一步，步骤2采用RT-PCR方法检测所述肌球蛋白重链亚型的MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIx和MyHCIIb的mRNA含量。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术发现了电脉冲刺激诱导成肌细胞收缩,进而诱发乳酸分泌增多的现象，同时建立了4天电脉冲刺激小鼠成肌细胞且在电脉冲刺激后36h能够诱发细胞中甘油三酯堆积模型，从而得出无氧代谢糖酵解产物乳酸在运动训练诱导骨骼肌细胞脂滴堆积和线粒体功能蛋白增加方面承担重要角色。(2)本专利技术建立的体外电脉冲刺激肌细胞收缩诱发能源物质脂滴堆积和线粒体功能增强，将有助于基础研究和临床上老年人肌力下降和卧床病人肌萎缩的骨骼肌功能恢复。(3)本专利技术的方法简单，操作容易，适合规模化应用。附图说明图1为一次性电脉冲刺激(电压30V/10mm，频率0.5Hz，单次时长2ms，共3h)对C2C12肌管细胞中乳酸含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数N＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。图2为一次性为电脉冲刺激(电压30V/10mm，频率1Hz，单次时长2ms，共3h)对C2C12肌管细胞中乳酸含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数N＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。图3为一次性电脉冲刺激(电压30V/10mm，频率5Hz，单次时长2ms，共3h)对C2C12肌管细胞中乳酸含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数N＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。图4为一次性电脉冲刺激(电压30V/10mm，频率10Hz，单次时长2ms，共3h)对C2C12肌管细胞中乳酸含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数N＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。图5为一次性电脉冲刺激(电压30V/10mm，频率0.5Hz，单次时长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：细胞培养将小鼠成肌细胞接种于细胞培养基中，培养后，加入消化液，进行细胞消化，然后，将消化后的细胞铺入6孔板，当6孔板中的细胞融合到90‑95％时，将细胞培养基更换为细胞分化培养基，每24h更换一次细胞分化培养基，分化4‑6天；步骤2：电脉冲刺激实验组：电脉冲刺激每天1次，共持续4天；其中，第1天和第2天：电压14V/10mm，单次脉冲时长2ms，频率1Hz，每天总时长2h；第3天和第4天：电压30V/10mm，单次脉冲时长2ms，频率0.5‑10Hz，每天总时长3h；每次电脉冲刺激前1h，每孔更换2‑3mL新鲜的细胞分化培养基；在第3天电脉冲刺激后即刻收集细胞，分别测定乳酸和ATP含量；同时在第3天电脉冲刺激后3h收集细胞，分别检测肌球蛋白重链亚型MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIx和MyHCIIb的mRNA含量；分别在第4天电脉冲刺激后12h、24h和36h收集细胞，测定甘油三酯含量；同时，设定对照组，即不进行电脉冲刺激，其余同实验组；步骤3：模型的建立与对照组相比，当步骤2测定的实验组的第3天电脉冲刺激后即刻肌管细胞中乳酸含量显著升高，即独立样本t检验的显著性水平P值<0.05；且第3天电脉冲刺激后即刻肌管细胞中ATP含量显著降低，即独立样本t检验的显著性水平P值<0.05；且第3天电脉冲刺激后即刻肌管细胞中肌球蛋白重链亚型出现显著改变时，即独立样本t检验的显著性水平P值<0.05；且第4天电脉冲刺激后12h、24h和36h的甘油三酯含量增加50％以上，即建立所述运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型。...

【技术特征摘要】
1.一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：细胞培养将小鼠成肌细胞接种于细胞培养基中，培养后，加入消化液，进行细胞消化，然后，将消化后的细胞铺入6孔板，当6孔板中的细胞融合到90-95％时，将细胞培养基更换为细胞分化培养基，每24h更换一次细胞分化培养基，分化4-6天；步骤2：电脉冲刺激实验组：电脉冲刺激每天1次，共持续4天；其中，第1天和第2天：电压14V/10mm，单次脉冲时长2ms，频率1Hz，每天总时长2h；第3天和第4天：电压30V/10mm，单次脉冲时长2ms，频率0.5-10Hz，每天总时长3h；每次电脉冲刺激前1h，每孔更换2-3mL新鲜的细胞分化培养基；在第3天电脉冲刺激后即刻收集细胞，分别测定乳酸和ATP含量；同时在第3天电脉冲刺激后3h收集细胞，分别检测肌球蛋白重链亚型MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIx和MyHCIIb的mRNA含量；分别在第4天电脉冲刺激后12h、24h和36h收集细胞，测定甘油三酯含量；同时，设定对照组，即不进行电脉冲刺激，其余同实验组；步骤3：模型的建立与对照组相比，当步骤2测定的实验组的第3天电脉冲刺激后即刻肌管细胞中乳酸含量显著升高，即独立样本t检验的显著性水平P值&lt;0.05；且第3天电脉冲刺激后即刻肌管细胞中ATP含量显著降低，即独立样本t检验的显著性水平P值&am...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙景权，上官若男，韩海军，李松波，严翊，谢敏豪，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51