本发明专利技术公开了制备用于核酸扩增反应的据推测含有目标核酸序列的样品和证明样品制备的有效性的方法，该方法包括将样品与样品制备对照物混合的步骤。所述样品制备对照物为包含标记物核酸序列的细胞、孢子、微生物或病毒。与样品制备对照物混合后的样品经受裂解处理，且裂解处理所释放的核酸置于核酸扩增条件下。然后测定目标核酸序列和标记物核酸序列是否存在。标记物核酸序列的阳性检测结果表明样品制备方法是令人满意的，而不能检测出标记物核酸序列则表明不充分的样品制备。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】并通过结合磷脂，集中在血小板细胞表面。磷脂结合包含FVIH残基 2199、 2200、 2251和2252 (Gilbert等，2002， J. Biol. Chem. 277， pp. 6374- 6381)。在这里，它通过与FVIII残基558-565 (Fay等，1994， J. Biol. Chem. 269， pp. 20522-20527)和1811-1818 (Lenting等，1996， J. Biol. Chem. 271， pp. 1935- 1940)的相互作用，结合FIX,并通过与 FVIII残基349-372 (Nogami等，2004， J. Biol. Chem. 279, pp. 15763-15771)的相互作用，结合FX，并作为FX的FIX激活的辅因 子，所述FX是内源性凝结途径的基本组分。激活的FVIII (FVIIIa) 受到蛋白酶激活的蛋白C(APC)的部分灭活，这通过在FVIII残基336 和562后面的切割来实现(Regan等，1996， J. Biol. Chem. 271, pp. 3982-3987)。但是，灭活的主要决定因素是A2结构域从Al和A3-C1-C2 解离(Fay等，1991， J. Biol. Chem. 266， pp. 8957-8962)。已经证实增加蛋白的体内半衰期的一种方法是PEG化 (PEGyladon )。 PEG化是长链聚乙二醇(PEG)分子向蛋白或其它分 子的共价附着。PEG可以是线性形式或分支形式，以产生具有不同特 征的不同分子。除了增加肽或蛋白的半衰期以外，PEG化已经用于减 少抗体发展，保护蛋白免受蛋白酶消化，和保持材料在肾滤液的外面 (Harris等，2001, Clinical Pharmacokinetics 40， pp. 539-51)。另夕卜， PEG化也可以增加蛋白的总稳定性和溶解度。最后，PEG化蛋白的 持续的血浆浓度，可以通过减少药物的低谷至顶点水平降低不利的副 作用的程度，从而消除对在早期时间点引入超生理水平的蛋白的需 要。通过用大聚合物(如PEG和葡聚糖)靶向伯胺(N-末端和赖氨 酸)来随机修饰FVIII的尝试，已经取得不同程度的成功 (W094/15625、美国专利4970300、美国专利6048720)。在1994年 专利申请(W094/15625)中公开的最显著的提高，显示了 4倍半衰期提 高，但是代价是，在全长FVIII与50倍摩尔过量的PEG反应后，丧 失2倍活性。WO2004/075923公开了通过随机修饰生成的FVIII和聚 乙二醇的缀合物。在过去，已经批准随机地PEG化的蛋白如干扰素 a(Kozlowski等，2001， BioDrugs 15, pp. 419- 429)用作治疗剂。但是，对于异源二聚体的FVIII,该随机方案更容易出问题。FVIII 具有数百个潜在的PEG化位点，包括158个赖氨酸，2个N-末端和 目标核酸序列以及标记物核酸序列是否存在。对标记物核酸序列的阳性 检测结果说明样品制备方法是令人满意的，而不能检测到标记物核酸序 列则说明样品制备不充分。在某些实施方案中，裂解室包含固相材料，并且所述方法还包括以下步骤推动与样品制备对照物混合的样品流经裂解室，以便在裂解处 理前以固相材料捕获样品制备对照物和目标实体(假使存在于所述样品 中)。在某些实施方案中，固相材料包括至少一个其孔径足以捕获样品制 备对照物和目标实体的滤器。在样品与样品制备对照物混合之前可对样 品进行预过滤(例如除去粗粒物质)。在某些实施方案中，裂解处理包括 使用结合到裂解室的壁的超声换能器使样品制备对照物和目标实体经受 超声能处理。该裂解处理可任选地包括搅动裂解室中的小珠(bead)。在 某些实施方案中，样品制备对照物是孢子。在某些实施方案中，混合步 骤包括溶解含有样品制备对照物的干燥小珠。在某些实施方案中，裂解 处理包括与化学裂解试剂接触。在某些实施方案中，核酸扩增条件包括 聚合酶链式反应(PCR)条件。在某些实施方案中，通过确定来自能结合 标记物核酸序列的探针的信号是否超出阈值来检测标记物核酸序列是否 存在。另 一 方面，本专利技术提供了制备用于核酸扩增反应的样品和证明样品 制备的有效性的装置。该样品据推测含有选自细胞、孢子、微生物及病 毒的目标实体，且目标实体包括至少一种目标核酸序列。该装置包括主 体，该主体具有包含要与样品混合的样品制备对照物的第一室。样品制 备对照物选自细胞、孢子、微生物及病毒，且样品制备对照物包含标记 物核酸序列。该主体还具有裂解室，用于使样品制备对照物和目标实体 (假使存在于样品中)经受裂解处理，以从中释放核酸。该主体还具有 用于容纳核酸以便扩增和检测的反应室。该装置还包括至少一个流动控 制器，用于引导与样品制备对照物混合的样品从第一室流入裂解室，一 以及引导在裂解室中释放的核酸流入反应室。该装置还包含引物和探针， 用于扩增和检测标记物核酸序列及所述至少一种目标核酸序列。在某些实施方案中，裂解室包含固相材料，其用于当样品流经裂解 室时捕获样品制备对照物和目标实体(假使存在于样品中)。该装置还包 括至少一个用于接收已流经裂解室的废样品液的废液室，以及所述至少 一个流动控制器还能够引导已流经裂解室的废样品液流入废液室。在某 些实施方案中，固相材料包括至少一个滤器，其孔径足以捕获样品制备 对照物和目标实体。在某些实施方案中，该装置还包括结合到裂解室的 壁以对裂解室进行超声处理的超声换能器。在某些实施方案中，该装置 还包括裂解室中用于使样品制备对照物和目标实体破裂的小珠。在某些 实施方案中，样品制备对照物是孢子。在某些实施方案中，样品制备对 照物位于可溶解于液体的干燥小珠内。在某些实施方案中，引物和探针 位于反应室中的干燥小珠内，该小珠可溶于液体。在某些实施方案中， 所述主体包括连接到反应室的混合室，以及引物和探针位于混合室中的 干燥小珠内，该小珠可溶于液体。另一方面，本专利技术提供了测定裂解过程的有效性的方法。该方法包 括使样品制备对照物与据推测包含目标实体的样品混合的步骤，其中该 目标实体选自细胞、孢子、微生物及病毒。目标实体包含至少一种目标 核酸序列。样品制备对照物选自细胞、孢子、微生物及病毒，且包含标 记物核酸序列。样品制备对照和目标实体(假使存在于样品中)的混合 物经受裂解处理。本方法还包括下述步骤，即检测标记物核酸序列是否 存在，以测定在裂解处理期间核酸是否从样品制备对照物释放。标记物 核酸序列的阳性检测结果表示令人满意的裂解，而不能检测到标记物核 酸序列则表示不充分的裂解在某些实施方案中，所述方法还包括下述步骤，即推动与样品制备 对照物混合的样品流经含有固相材料的室，从而在裂解处理前借助固相 材料捕获样品制备对照物和目标实体(假使存在于样品中)。在某些实施 方案中，固相材料包括至少一个滤器，其孔径足以捕获样品制备对照物 和目标实体。在某些实施方案中，在使样品与样品制备对照物混合前对 样品进行预过滤。在某些实施方案中，裂解处理包括使样品制备对照物 和目标实体经受超声能处理。裂解处理也可包括搅动小珠以使样品制备对照物和目标实体破裂。在某些实施方案中，样本文档来自技高网...
【技术保护点】
制备用于核酸扩增反应的样品并证明所述样品制备的有效性的方法，所述样品据推测含有选自细胞、孢子、微生物和病毒的目标实体，所述目标实体包含至少一种目标核酸序列，所述方法包括下列步骤： ａ）将所述样品引入一装置，所述装置具有： ｉ）混合室，用于使所述样品和样品制备对照物混合，所述样品制备对照物选自细胞、孢子、微生物和病毒，并且所述样品制备对照物包含标记物核酸序列； ｉｉ）裂解室； ｉｉｉ）反应室； ｂ）使所述样品和所述样品制备对照物在所述混合室中混合； ｃ）使所述样品制备对照物与假使存在于所述样品中的目标实体在所述裂解室中经受裂解处理； ｄ）使在所述裂解室中释放的核酸处于所述反应室中的核酸扩增条件下；以及 ｅ）检测所述目标核酸序列以及所述标记物核酸序列是否存在； 由此检测出所述标记物核酸序列表示令人满意的样品制备。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：威廉麦克米伦，
申请(专利权)人：塞弗德公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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