一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D‑二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡制造方法及图纸

本发明专利技术涉及医药领域，公开了一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D‑二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡，该微泡为磷脂质地，微泡上负载有溶栓药物，微泡表面附有D‑二聚体单克隆抗体。本发明专利技术的载药微泡可以通过D‑二聚体单克隆抗体和血栓上的D‑二聚体特异性结合，从而使载药微泡与血栓粘附，再经体外超声波辐照产生惯性空化作用致体内载药微泡破裂，实现溶栓药物的定点释放。药物局限在血栓部位，无创伤、出血风险低，并且其药物剂量小、操作可控，溶栓效果好。

A method for treatment of pulmonary thromboembolism in D two mer monoclonal antibody targeted microbubbles containing urokinase device

The present invention relates to the field of medicine, for treating pulmonary thromboembolism in D two mer monoclonal antibody targeted microbubbles containing urokinase device is disclosed, the microbubbles as phospholipids, microbubble loaded with thrombolytic drugs, microbubbles with D monoclonal antibody two dimer. The invention of the drug loaded microbubbles can D dimers with two monoclonal antibodies and thrombosis on D two dimer specific binding, so that the drug loaded microbubbles and thrombus adhesion by ultrasonic irradiation in vitro, the generation of inertial cavitation induced by in vivo drug loaded microbubbles rupture, fixed point of thrombolytic drug release. The drug is limited to the site of thrombus, and the risk of no trauma and bleeding is low, and the dosage is small, the operation is controlled, and the thrombolytic effect is good.

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D-二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡
本专利技术涉及医药领域，尤其涉及一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D-二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡。
技术介绍
肺血栓栓塞症(Pulmonarythromboembolism,PTE)是来自静脉系统或右心的血栓阻塞肺动脉及其分支所导致的以肺循环和呼吸功能障碍为主要临床表现和病理生理特征的疾病。PTE过去被认为一种罕见病，但近年来由于人们对PTE的诊断意识和水平的提高，PTE诊断率显著提高，目前认为其发病率在心血管疾病中仅次于高血压和冠心病，在中国，PTE在尸检中的发生率为3%-11%，是一种常见病。而且该疾病死亡率很高。在美国，肺栓塞每年引起约100000例死亡。在欧洲，肺栓塞每年引起300,000例死亡；其死亡率仅次于恶性肿瘤和心肌梗死，是临床上常见的一种危害很大的疾病。目前临床上用于治疗PTE的方式主要有：抗凝治疗、溶栓治疗、导管介入、外科碎栓和放置下肢腔静脉滤器等。抗凝治疗：口服华法令或静脉、皮下注射低分子肝素、磺达肝癸钠、利伐沙班等抗凝药物，必要时定期监测凝血功能。溶栓治疗：静脉滴注或注射尿激酶、链激酶、和重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)。溶栓治疗后每2～4h测定1次活化部分凝血活酶时间(APTT)。导管介入：导管局部溶栓术是通过肺动脉造影确定堵塞的肺动脉部位，然后导管尖端置于血栓处，将尿激酶、链激酶或重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂直接注入血栓处，新鲜血栓在足量溶栓剂作用下大约在30分钟内溶解。局部机械血栓切除消散术是利用导管头端高转速刀片旋转产生负压可将距导管头1.5cm之内的血栓吸入并将血栓块碎解成可顺利通过微循环的微粒。外科取栓：通过外科手术摘除肺动脉血栓。放置下肢腔静脉滤器：通过置入腔静脉滤器后,防止滤器水平以下深静脉血栓栓子再脱落引起急性肺血栓栓塞症。虽然目前有不少治疗PTE的手段，但都有局限性。抗凝和溶栓药物能溶解血栓，但同时有加重出血的风险，目前临床上许多病人诊断PTE同时又存在活动性出血或出血高风险（手术部位出血，脑出血，凝血功能障碍等等），这就限制了这些药物的使用。在抗凝药物和溶栓药物禁忌的情况下，导管介入下行肺动脉取栓和溶栓可以考虑使用，但这种方法为有创性，风险大，可能引起心脏骤停，出血甚至死亡，很多单位难以开展。至于外科取栓则是须在体外循环下开展的一类高风险手术，风险更大，死亡率更高，一般医院很难开展。而下腔静脉滤器只能用于肺栓塞的预防，无法治疗肺栓塞。因此，寻找一种安全有效的治疗PTE的新方法，并能弥补上述治疗方法的不足，迫在眉睫。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D-二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡，本专利技术的载尿激酶微泡可以通过D-二聚体单克隆抗体和血栓上的D-二聚体特异性结合，从而使载药微泡与血栓粘附，再经体外超声波辐照产生惯性空化作用致体内载药微泡破裂，实现溶栓药物的定点释放。药物局限在血栓部位，无创伤、出血风险低，并且其药物剂量小、操作可控，溶栓效果好。本专利技术的具体技术方案为：一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D-二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡，所述微泡为磷脂质地，微泡负载有溶栓药物，微泡表面附有生物素化D-二聚体单克隆抗体。导致PTE的是静脉血栓，其内含有大量的D-二聚体（纤维蛋白的降解产物，由此本专利技术团队联设想是否可以制作一种以D-二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡：微泡表面附有D-二聚体单克隆抗体，通过该抗体微泡特异性地和血栓上的D-二聚体结合，从而与血栓粘附；同时微泡上载有溶栓药物，当微泡和血栓结合后，在体外通过超声探头将微泡爆破，微泡上的溶栓药物即可被释放，发挥溶栓作用。因为该技术仅在血栓部位释放溶栓药物，故所需药物剂量小，且对其他部位、包括出血部位无影响，故出血风险小，且无创。并联合UTMD技术治疗肺栓塞。和抗凝和溶栓相比，该方法出血风险小；与介入和外科手术取栓比较，该方法为无创伤性，而且很容易普及。在本专利技术人的先前研究中，制得了靶向载药脂质体，并在兔急性肺动脉栓塞模型中进行实验，但该实验存在一定的局限性。首先，这种脂质体靶向系统存在药物释放不可控，自身稳定性欠佳等缺点，仍存在引起其他器官出血的潜在风险，尤其对临床上诊断PTE同时又存在活动性出血或出血风险高（手术部位出血，脑出血，凝血功能障碍等等）的病人。而本专利技术方案所用的靶向载药微泡可以通过体外超声波辐照产生惯性空化致体内载药微泡破裂，实现溶栓药物的定点释放，将药物局限在血栓部位，进一步降低其他器官的出血风险，将来可用于治疗临床上诊断PTE同时又存在活动性出血或出血风险高的病人。另外，先前实验使用的是直径2mm、长5mm血栓，而急性肺栓塞患者的血栓往往要大很多，所以同样的方法在人体试验中并不一定取得良好的溶栓效果。而本方案采用的溶栓药物联合低频超声局部照射将有更好的溶栓效果。低频超声可以通过其空化作用、微流作用、机械效应、细胞内微电流及热效应等，使血栓发生一系列结构性改变(如血栓内部结构松散，表面出现裂缝、针孔等)，增加溶栓药对血栓的渗透性，使其深入血栓内部，更好地与血栓接触，发挥更强的溶栓作用，用于治疗大块肺栓塞患者。作为优选，所述溶栓药物为尿激酶。作为优选，所述微泡的粒径为1.2-2.2微米。作为优选，所述载尿激酶微泡的制备方法如下：1）超声微泡的制备：取摩尔比为80-90:8-12:3-5的二硬脂酰基磷脂酰胆碱、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000，溶解于三氯甲烷中并在涡旋混合器上混匀；用干燥的氮气除去三氯甲烷，于真空烘箱中干燥2h以上；加入脱气的Tris缓冲溶液，得到2.5-3.5mg/mL的磷脂溶液；将磷脂溶液加热至相变温度，用水浴超声振荡器使溶液分散至透明，分装入的西林瓶中；将瓶中的空气置换成全氟丙烷，用铝塑盖和橡胶塞封口，再用机械振荡器振荡40-50s，制得超声微泡。2）载药微泡的制备：将所述超声微泡与尿激酶混合，孵育1.5-2.5h，低速离心，洗涤，制得载药微泡。3）生物素化抗体的制备：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体透析，加入PLTK微孔滤膜管中，再向管中加入一定量的N-羟基琥珀酰哑胺生物素酯(1mg/mL)，孵育后离心，加入PBS，混匀后再次离心，去除外管滤液，制得生物素化D-二聚体单克隆抗体。4）载药微泡与抗体的链接：将载药微泡加入到过量的链亲和素中，低温振荡孵育25-35min后，反复低温、低速离心洗涤；加入步骤3）制备的生物素化D-二聚体单克隆抗体，再经25-35min低温孵育，反复低温、低速离心洗涤，制得成品。作为优选，步骤1）中，所述Tris缓冲溶液中含有体积分数为8-12％的甘油和体积分数为8-12％丙二醇。作为优选，步骤1）中，所述磷脂溶液的相变温度为55-60℃。作为优选，步骤2）中，所述尿激酶与超声微泡的用量比为10000-100000U/mL；低速离心的速率为280-320xg，离心时间为2-4min，洗涤次数为2-4次。作为优选，步骤2）中制得载药微泡后，在400倍的光镜下观察载药微泡的大小、形态及分布，以分布均匀、分散性好及未见明显聚集的微泡为合格；若制得微泡大小相差巨大，分布不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D‑二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡，其特征在于：所述微泡为磷脂质地，微泡负载有溶栓药物，微泡表面附有生物素化D‑二聚体单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D-二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡，其特征在于：所述微泡为磷脂质地，微泡负载有溶栓药物，微泡表面附有生物素化D-二聚体单克隆抗体。2.如权利要求1所述的一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D-二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡，其特征在于，所述溶栓药物为尿激酶。3.如权利要求1所述的一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D-二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡，其特征在于，所述微泡的粒径为1.2-2.2微米。4.如权利要求1-3之一所述的一种用于治疗肺血栓栓塞症的以D-二聚体单克隆抗体为靶向装置的载尿激酶微泡，其特征在于制备方法如下：1）超声微泡的制备：取摩尔比为80-90:8-12:3-5的二硬脂酰基磷脂酰胆碱、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000，溶解于三氯甲烷中并在涡旋混合器上混匀；用干燥的氮气除去三氯甲烷，于真空烘箱中干燥2h以上；加入脱气的Tris缓冲溶液，得到2.5-3.5mg/mL的磷脂溶液；将磷脂溶液加热至相变温度，用水浴超声振荡器使溶液分散至透明，分装入的西林瓶中；将瓶中的空气置换成全氟丙烷，用铝塑盖和橡胶塞封口，再用机械振荡器振荡40-50s，制得超声微泡；2）载药微泡的制备：将所述超声微泡与尿激酶混合，孵育1.5-2.5h，低速离心，洗涤，制得载药微泡；3）生物素化抗体的制备：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体透析，加入PLTK微孔滤膜管中，再向管中加入的N-羟基琥珀酰哑胺生物素酯，孵育后离心，加入PBS，混匀后再次离心，去除外管滤液，制得生物素化D-二聚体单克隆抗体；4）载药微泡与抗体的链接：将载药微泡加入到过量的链亲和素中，低温振荡孵育25-35min后，反复低温、低速离心洗涤；加入步骤3）制备的生物素化...

【专利技术属性】
技术研发人员：章锐锋，梁黎，马国锋，许晓玲，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属邵逸夫医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33