【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质组学，具体为一种可同时高效富集多种蛋白质翻译后修饰肽段的方法和体系。
技术介绍
1、蛋白质翻译后修饰组学是研究蛋白质在翻译后经过各种修饰的全过程的科学领域，在细胞中，蛋白质的合成并不仅仅是由基因的转录和翻译所决定的，而且还受到后续的修饰过程的调控，这些修饰过程可以影响蛋白质的结构、功能、定位以及与其他分子的相互作用。
2、目前通用的蛋白质翻译后修饰组学方法的步骤主要为：
3、尿素裂解液裂解组织或细胞>胰蛋白酶等酶解蛋白质为肽段>富集含有翻译后修饰的肽段>质谱检测；
4、这其中最关键的步骤为富集含有翻译后修饰的肽段，现有检测多种翻译后修饰的方案为依次富集不同的翻译后修饰，该方案存在耗时较久且肽段损失较多的缺点，同时富集效率不高。
5、综上，需要提出一种可同时高效富集多种蛋白质翻译后修饰肽段的方法和体系来解决上述问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种可同时高效富集多种蛋白质翻译后修饰肽段的方法和体系，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种可同时高效富集多种蛋白质翻译后修饰肽段的方法，包括以下步骤：
4、s1.样本制备，使用尿素裂解液裂解组织或细胞，通过胰蛋白酶将蛋白质水解为肽段；
5、s2.富集方案，使用液体缓冲体系进行富集，缓冲液包括mops、naoh、na2hpo4、nacl、ac
6、s3.质谱检测，对富集后的样品进行质谱检测，包括二级质谱分析、多种ptm定量分析、多种ptm序列分析以及多种ptm蛋白通路分析，用于一次性鉴定多种翻译后修饰的肽段。
7、优选的，所述步骤s1样本制备的具体步骤包括：
8、s1-1.样本制备：使用1ml完全尿素裂解液对每2000万细胞或100mg组织进行裂解；-80℃保存24小时后，4℃融化，15000g4℃离心10-30分钟并取上清；测定蛋白浓度，-80℃长期保存；
9、s1-2.样品处理：样品浓度不小于2ug/ul为佳；加入dtt，30℃孵育45分钟；室温冷却后加入氯乙酰胺，避光室温25℃孵育30分钟；使用zeba除盐柱进行除盐；
10、s1-3.消化过程：使用猪胰蛋白酶，样品蛋白＝1:40，37℃摇床150rpm消化14小时；取出后4℃静置10分钟；
11、s1-4.酸性处理：加入tfa使终浓度为1；4℃静置10分钟，4℃1800g离心15分钟；上清转移到新的离心管进行标记；
12、s1-5.肽段纯化：使用c18除盐柱，依次使用不同缓冲液洗脱，包括acn、0.1％tfa+50％acn、0.1％tfa；酸化肽段，再使用0.1％fa+50％acn洗脱，进行标记；
13、s1-6.冻干：对样品进行冻干处理；
14、s1-7.完全尿素裂解液：尿素裂解液包括8m尿素、50mmtris-hcl、150mmnacl；现配加入蛋白酶抑制剂混合物、磷酸化酶抑制剂混合物、乙酰化酶抑制剂混合物，以及50umpr-619。
15、优选的，所述步骤s2富集方案具体包括如下步骤：
16、s2-1.准备缓冲液，制备液体缓冲体系，其主要成分包括：
17、40mm至50mm的mops(3-(n-morpholino)propanesulfonicacid)；
18、5mm至10mm的na2hpo4，用于调整溶液的盐度；
19、40mm至50mm的nacl，提供适度的离子强度；
20、5％乙腈，用于改变液相条件；
21、以0.1％的三氟乙酸用于调整溶液的酸度；
22、s2-2.样品溶解，将s1中制备的肽段用富集缓冲液溶解，涡旋和超声处理确保肽段充分溶解，离心去除沉淀，确保溶液澄清；
23、s2-3.孵育，在4摄氏度下进行用3d旋转混合仪孵育4小时；
24、s2-4.富集，使用亲和层析树脂富集介质，将含有翻译后修饰肽段的样品分离出来，根据富集介质的性质，进行多次清洗步骤以去除非特异性结合的成分；
25、s2-5.洗脱，使用洗脱缓冲液，将富集的肽段从富集介质上洗脱下来，洗脱缓冲液为1％tfa；
26、s2-6.除盐，使用c18除盐柱将洗脱液体中的盐分和残留琼脂糖成分去除；
27、s2-7.溶液旋干，将c18除盐后的洗脱液用真空旋转蒸发仪进行旋干。
28、优选的，所述步骤s3质谱检测的具体步骤为：
29、s3-1.质谱仪准备；
30、校准质谱仪的质谱范围为m/z300-2000；
31、设置离子源温度为250℃，毛细管电压为2.5kv；
32、s3-2.样品准备，将富集后样品，用10ul的2％acn+0.1％tfa溶液溶解；
33、s3-3.
34、使用自动进样器，每次进样量为5μl；
35、s3-4.装载样品，样品通过高性能液相色谱系统进入质谱仪；
36、流速设置为300nl/min，保证样品在进入质谱仪前的分离；
37、s3-5.质谱扫描，进行全扫描；
38、设置碎裂能量为27，以获取足够的碎裂信息；
39、s3-6.数据采集，使用质谱仪数据采集软件记录质谱图；
40、设置锁定母离子扫描，锁定20个最强的前体离子进行子扫描；
41、s3-7.数据分析，使用质谱数据分析软件，对质谱图进行处理；
42、设定质荷比容差为±0.01da，以提高鉴定的准确性；
43、s3-8.结果解释，鉴定肽段的修饰类型，设定相对丰度阈值为5％进行筛选；
44、s3-9.报告生成，生成实验结果报告，包括鉴定的肽段、修饰类型、相对丰度信息，以及二级质谱分析、多种ptm定量分析、多种ptm序列分析以及多种ptm蛋白通路分析图示结果。
45、优选的，所述步骤s1-2裂解的裂解液具体数值为8m尿素、50mm的tris-hcl(ph8.0)、150mm的nacl。
46、优选的，所述步骤s2-1准备缓冲液其主要成分具体为50mm的mops3-(n-morpholino)propanesulfonicacid，10mm的na2hpo4，用于调整溶液的盐度，50mm的nacl，提供适度的离子强度，5％乙腈，用于改变液相条件，以0.1％的三氟乙酸用于调整溶液的酸度。
47、一种可同时高效富集多种蛋白质翻译后修饰肽段的体系，由尿素裂解液裂解组织或细胞、缓冲液以及质谱检测仪构成。
48、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术可同时富集多种翻译后修饰肽段，节省了时间减少了过程中翻译后修饰肽段的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可同时高效富集多种蛋白质翻译后修饰肽段的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1样本制备的具体步骤包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S2富集方案具体包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S3质谱检测的具体步骤为：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
7.一种可同时高效富集多种蛋白质翻译后修饰肽段的体系，其特征在于，由尿素裂解液裂解组织或细胞、缓冲液以及质谱检测仪构成。
【技术特征摘要】
1.一种可同时高效富集多种蛋白质翻译后修饰肽段的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1样本制备的具体步骤包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤s2富集方案具体包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：季飞洋，朱惠惠，孙泽宇，周梦豪，姜正一，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属邵逸夫医院，
类型：发明
国别省市：
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