肺血栓栓塞症相关基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一组与肺血栓栓塞症相关基因，以及肺血栓栓塞症相关基因制备诊断肺血栓栓塞症试剂中的应用。本发明专利技术利用基因芯片技术，为诊断肺血栓栓塞症提供了一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物
，更具体地，本专利技术涉及一组与人类肺血栓栓塞症有关的基因及其应用。
技术介绍
肺栓塞是指全身静脉系统内的栓子游离后堵塞肺血管床，其中99％的栓子是血栓性质的，也称为肺血栓栓塞症(pulmonarythromboembolism PTE)，其栓子90％来源于腹腔和下肢血栓形成。目前，人们普遍认为肺栓塞和深静脉血栓形成是一个疾病的两个不同阶段。到目前为止，西方仅少数几个国家报道了群体研究中深静脉血栓形成和肺动脉血栓栓塞的估计发病率。在西方国家，总人群深静脉血栓形成和肺动脉血栓栓塞的年发病率超过10万例，几乎与心肌梗死一样常见。ICOPER多中心临床试验研究证实，发病率有明显升高趋势。尽管我国肺栓塞缺少大规模的流行病学研究，但诊断例数报道在逐年大幅升高。肺栓塞的临床表现呈多样化，较为复杂，肺栓塞患者的11％在发病1小时内死亡，特别是发生在术后并非鲜见，在临床中发现同样的手术并非都发生肺栓塞，仅为其中一部分。因此，欧美国家对不同危险因素和不同手术创伤采用了预防措施，包括药物预防和机械预防，即便如此，仍有发生肺栓塞，同时大面积预防缺少个体的特异性，也是资源的浪费。80％的肺栓塞患者是发生在30％的特定人群，因此在同样外部环境和创伤条件下，其内部因素的研究十分必要。近年来，众多学者提出了肺栓塞和深静脉血栓形成是由于遗传和/或环境异常造成的一种多基因/多因素疾病。人体中存在大量的基因突变，基因多态性、基因差异表达与之有关。凝血因子V基因Leiden突变、凝血酶原基因G20210A突变、活性蛋白C抵抗、蛋白C基因缺陷蛋白、蛋白S基因缺陷、抗凝血酶III基因突变、纤溶酶原遗传缺陷、纤溶酶原激活抑制物基因多态性、基因多态性所致高同型半胱氨酸血症、抗磷脂抗体综合症、血管紧张素转换酶(ACE)基因插入/缺失多态性等可能与肺栓塞发生发展有关。在我国由于对肺栓塞的认识起步较晚，致使我国肺栓塞的诊断、治疗、预防水平尚落后，大量国民因此病致伤、致残、死亡，特别是手术后发生的致死性肺栓塞患者屡见不鲜。因此，研究检测肺栓塞及深静脉血栓形成相关基因筛查的意义在于可以提供一种早期基因诊断的方法、可以深入探索肺栓塞和深静脉血栓形成的遗传机制，降低肺栓塞的发生率，死亡率，意义重大。基因芯片技术是一种高新的分子生物学技术。其基本原理是将大量核酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片已经被利用于探索和发现致病相关基因。本专利技术是通过利用基因芯片技术实现本专利技术的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一组与肺血栓栓塞症有关的相关基因，本专利技术另一个目的是上述相关基因在制备肺血栓栓塞症的诊断试剂盒中的应用。本专利技术是通过利用基因芯片技术筛选出与肺血栓栓塞症有关的相关基因，以实现本专利技术目的。具体步骤为(1)研究对象的选择随机收集临床影像学确定诊断的肺栓塞患者以及正常健康对照者，分为2组，男∶女＝1∶1(2)样本准备采集研究对象外周血，离心处理后，抽提粒细胞中总RNA，从纯化的总RNA中分离出mRNA。(3)探针制备本实验采用mRNA逆转录成cDNA，然后在T7 RNA聚合酶作用下以cDNA第二链为模版，以含有CyDye标记的CTP和无标记NTPs的核苷酸为底物，合成带有CyDye标记的cRNA。实验分别合成带Cy5和Cy3的荧光探针。(4)基因芯片的准备本实验采用美国Agilent公司的人类全基因组寡核苷酸芯片，芯片进行常规处理，芯片常规处理的方法根据Agilent芯片使用手册(Agilent low RNA input fluorescent linearamplification kit protocol)。(5)芯片杂交及处理取出经定量的Cy3和Cy5标记的荧光样品探针杂交于基因芯片上，杂交后经洗涤芯片等处理，立即进行扫描。(6)数据处理及分析图像扫描、数据读取、分析、标准化处理、Ratio分析、cluster软件聚类分析结果。(7)找出肺栓塞相关基因通过综合分析找出肺栓塞相关基因。下面结合实施例具体阐述本
技术实现思路
随机收集肺栓塞病人9例，正常健康对照者20例，男∶女＝1∶1，各抽取2ml静脉血，EDTA抗凝。将20例正常对照的血样各取100μl混合，用trizol法抽提得到RNA；9例肺栓塞病人血样分别用trizol法抽提得到RNA。经检测确认RNA质量合格后，进行标记杂交实验。实验标记方法采用Ambion线性放大(Ambion_MessageAmpTMIIaRNA Kit)和Agilent后标记方法相结合，其中病例组RNA采用cy3荧光标记，对照组RNA采用荧光cy5标记。Cy3探针取80pmol，cy5探针取40pmol进行杂交，杂交方法采用60℃，16小时滚动杂交，并在室温洗片。所用芯片为Agilent人全基因组oligo芯片，芯片产品目录号为G4112A。芯片结果采用Agilent扫描仪进行扫描，Imagene软件读取数据Scan resolution 10μm，PMT 70％，最后采用Feature Extration进行Normalize处理分析，得到ratio值(cy3/cy5)即实验组/对照组，比较两组的差异。即实验组/对照组。9例病人的结果进行聚类分析，根据统计分析原理，使用genespring和cluster分析软件，对具有相同统计行为的多个基因进行归类的分析方法，归为一个簇的基因在功能上可能相似或关联。在聚类分析后9例病人变化趋势相同的基因中，根据GO分类结合肺栓塞的发病原理，差异基因筛选标准为肺栓塞组与对照组相比较，凡是与血栓形成有关的凝血、纤溶发生上调或下调变化的基因均入选。表一，通过对肺栓塞患者发病期的外周血与正常人外周血的表达谱实验分析，通过cluster聚类以及GO分类信息找出在9例患者中变化趋势相同的基因，并根据本说明书差异基因筛选标准，从中筛选出与肺血栓栓塞症相关基因142个，所述基因在美国国立生物技术信息中心(NCBI)遗传序列数据库中，均有相应的GenBank号。具体见下表表肺血栓栓塞症相关基因 为实现本专利技术另一个专利技术目的，将上述与肺血栓栓塞症相关142个基因，合成的对应的寡核苷酸探针，通过接触式点样的方式，将探针固定在片基上，制备基因芯片及相关制备检测试剂，组成检测试剂盒，可应用于肺血栓栓塞症的早期检测和诊断。本专利技术具有良好的发展前景。基因序列表<110>同济人学附属同济医院<120>肺血栓栓塞症相关基因及其应用<160>142<210>1<211>2876<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<400>11 gaattcctgc agctcagcag ccgccgccag agcaggacga accgccaatc gcaaggcacc61 tctgagaact tcaggatgca gatgtctcca gccctcacct gcctagtcct本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组与肺血栓栓塞症相关的基因，其特征在于具有如ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７ 、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５、Ｓ ＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、Ｓ ＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、Ｓ ＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９、Ｓ ＥＱＩＤＮＯ：４０、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４５、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、ＳＥＱＩＤＮＯ：４７、Ｓ ＥＱＩＤＮＯ：４８、ＳＥＱＩＤＮＯ：４９、ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：５１、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５３、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５５、Ｓ ＥＱＩＤＮＯ：５６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５７、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱＩＤＮＯ：５９、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３、Ｓ ＥＱＩＤＮＯ：６４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６５、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６、ＳＥＱＩＤＮＯ：６７、ＳＥＱＩＤＮＯ：６８、ＳＥＱＩＤＮＯ：６...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王乐民，
申请(专利权)人：同济大学附属同济医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]