与黄瓜有毛基因Ｇｌ紧密连锁的分子标记制造技术

本发明专利技术涉及的是一种基因工程技术领域的与黄瓜有毛基因Ｇ１紧密连锁的分子标记。它由上游引物（Ｓ－Ｍ４Ｅ３－Ｆ）和下游引物（Ｓ－Ｍ４Ｅ３－Ｒ）组成，并包括上游和下游引物ＰＣＲ扩增得到的核苷酸序列，该核苷酸序列具有序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．１中７１６个核苷酸序列。它是由ＳＲＡＰ引物（ＭＥ４和ＥＭ３）ＰＣＲ扩增得到的核苷酸序列，该核苷酸序列具有序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．４中７３８个核苷酸序列。本发明专利技术可用于黄瓜分子标记辅助育种，加速黄瓜品种育种进程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种基因工程
的分子标记。特别是一种与黄瓜有 毛基因Gl紧密连锁的分子标记。技术背景黄瓜(Cucumis sativus L )是葫戶禾斗(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis) 一年蔓生的草本植物，原产温暖湿润的喜马拉雅山南麓的印度北部地区，传入我 国栽培已有2000多年的历史，我国是黄瓜的次生起源中心。黄瓜作为世界十大 重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。黄瓜植株茎、叶、巻须、花 萼、子房表面均覆有刚毛，多数子房表面有瘤状突起，瘤上有刺。黄瓜果实属于 瓠果，由子房和花托共同发育而成，果实均有刺，但是有些品种果实上没有果瘤。 通过组织学观察，黄瓜叶片上的刚毛和果实上的果刺形态结构一样，均为多细胞 无腺体的表皮毛。Robinson曾在1964年通过辐射诱变产生了黄瓜无毛类型突变体，该隐性突 变基因命名为glabrous (gl)，该突变体表现为茎、叶、巻须、花萼、子房均没 有表皮毛，果实表面也没有果刺和果瘤(cucumber gene list, 2001)。山东农 业大学的曹辰兴于1997年在华北类型黄瓜地方品种"大青把"(表现为植株有 毛、有果剌和果瘤)自交后代群体中发现无毛类型的自然突变体，其表现为茎、 叶、巻须、花梗、花萼、子房表面均光滑无刚毛，果实表面无刺无瘤(曹辰兴， 郭红芸.黄瓜突变新类型一无毛黄瓜.中国蔬菜，1999， 4: 29)。用无毛类型突 变体与有毛类型野生型杂交，正反交子一代均恢复有毛性状，表明植株毛的有无 的性状为细胞核基因控制，通过F2和BC1群体的遗传分析，结果表明有毛(G1) 为显性，无毛(gl)为隐性，并且茎、叶、巻须等表面的表皮毛性状为一对核基 因控制。用无毛黄瓜的花粉给普通有毛黄瓜的有刺无瘤(tutu)自交系授粉，子 一代植株果实表面有刺有瘤，通过分离群体的遗传分析结果表明控制茎、叶、果实表皮毛性状的无毛基因对控制果瘤性状的果瘤基因存在隐性上位作用(曹辰兴 等.黄瓜茎叶无毛性状与果实瘤剌性状的遗传关系.园艺学报，2001， 28(6): 565-566.)，天津黄瓜研究所也在1999年发现了无毛黄瓜的自然突变体，其表现 型与以前发现的突变体一致，遗传分析结果也是一对核基因控制的显性性状(马 德华等.黄瓜无毛突变体的生理特性研究.园艺学报，2002， 29(3): 282-284)。 这些突变体为黄瓜叶片刚毛和果刺的形成机理研究提供了理想的材料。但是，目 前国内外对于黄瓜无毛突变体仅限于遗传规律分析和生理特性的研究，对于黄瓜 果剌形成的分子机制研究却从未有报道。图位克隆(map-based cloning),又称定位克隆(positional cloning), 图位克隆方法可以在基因产物未知的情况下，根据功能基因在基因组中的位置进 行，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因定位到染色体的一个具 体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分 子标记，不断縮小候选区域进而克隆该基因。图位克隆方法的应用需要具备几个 条件具有高密度的分子图谱；具有大片段的基因组文库(BAC或YAC文库)及 物理图谱；亲本间具有较高多态性的分离群体等。图位克隆技术主要包括以下几 个步骤l.寻找与目标基因紧密连锁的分子标记。常用的标记筛选方法主要有分 离群体分组分析法(Bulked Segregant Analysis, BSA)和近等基因系法(Near-isogenic lines)。配制特殊的遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分 子标记的关键环节。2.筛选含有大插入片段的基因组文库。常用的文库有BAC(Bacterial artificial chromosome)文库、YAC(Yeast artificial chromosome) 文库，用与目标基因连锁的分子标记筛选基因组文库，得到阳性克隆。3.目的基 因区域的精细定位。用阳性克隆的末端作为探针筛选基因组文库，进行染色体步 移，直到获得目标基因附近的大片段重叠群，通过整合己有的遗传图谱和寻找新 的分子标记，提高目的基因区域的图谱密度。4.目的基因的分离。利用侧翼分子 标记分析大群体，将目的基因定位在一个BAC克隆上，分离阳性克隆。5.目标基 因的鉴定。阳性克隆中可能含有多个候选基因，找到候选基因后，通过分离群体 的共分离分析或进行功能互补实验验证基因功能，其它方法如检査cDNA时空表 达特点是否与表型一致、测定cDNA序列査询数据库、筛选突变体文库，找出DNA序列的变化和功能的关系都可以作为鉴定方法。但是黄瓜的基因组学研究较落 后，至今没有在黄瓜上成功利用图位克隆方法克隆基因的例子，其最主要原因是 不能有效获得与目标基因紧密连锁的分子标记。利用分子标记进行基因定位，首先必须找到与该性状紧密连锁的分子标记。 相关序歹lj扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)标 记是2001年由Li等提出的一种新型的基于PCR的分子标记(Li， G. andQuiros， C. F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet. 2001,103,455-461.)，该标记旨在通过独 特的引物设计扩增基因组的开放阅读框(open reading frames, ORF)部分。它 的引物设计思想建立在基因组研究的统计性规律(即基因的外显子部分G/C 含量较高，而内含子、启动子、基因间序列等部分A/T含量较高)基础上。它的 正向引物长度为17个碱基，其中5'端前10个碱基为随机的填充性序列，第 11-14为CCGG核心序列，最后面3个为随机的选择性碱基；反向引物一般18个 碱基，5'端前ll个也是填充性序列，紧接为AATT核心序列，最后也是3个选 择性碱基。SRAP标记具有稳定性好、多态性高和广泛适用的优点，同时该标记 的最大优点是较RAPD、 AFLP等标记容易找到与目标基因紧密连锁的分子标记。 所以找到与Gl基因紧密连锁的标记，可为下一步图位克隆这个基因打下坚实的基础。果实是黄瓜经济性状最重要的部分，随着人们生活水平的提高，品质育种 己提到重要位置。果实的品质分为感观品质、风味品质和营养品质，目前已鉴定 的品质基因多为感观品质基因，如果瘤有无、果剌颜色、果刺多少、果皮颜色和 果皮组织结构等等。欧美温室类型的黄瓜为无果瘤、少刺的果皮，称其为"水果" 黄瓜，其市场价格为普通黄瓜的2 — 3倍。外观光滑的黄瓜污染少，清洗方便，食用卫生，是无公害蔬菜的理想品种。经检测表明无瘤少刺黄瓜果肉农药残留量比有刺黄瓜低27%，果皮农药残留量低18%。黄瓜有毛基因Gl控制果刺的形 成，它的研究将会加速品质育种进程，与有毛G1连锁的分子标记也可以应用到 黄瓜分子标记辅助育种的过程中。由于黄瓜无毛基因gl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与黄瓜有毛基因Ｇｌ紧密连锁的分子标记，其特征在于，它由上游引物（Ｓ－Ｍ４Ｅ３－Ｆ）和下游引物（Ｓ－Ｍ４Ｅ３－Ｒ）组成，并包括上游和下游引物ＰＣＲ扩增得到的核苷酸序列，该核苷酸序列具有序列表中ＳＥＱＩＤＮＯ．１中７１６个核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：关媛，蔡润，潘俊松，蒋苏，吴爱忠，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]