分离棒酸及其药学上可接受的盐的新方法技术

从Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｐ６６２１ＦＥＲＭ Ｐ２８０４水性发酵肉汤分离棒酸及其药学上可接受的盐（如棒酸钾）的新的改进方法，即在介质ｐＨ５．８－６．２，温度约２０－４０℃的条件下用微量过滤法从发酵肉汤中除去菌丝体、大部分蛋白质和其它悬浮的固体颗粒，可任选地再用超滤法提纯已提纯过的肉汤（水相）。将这样提纯的肉汤用反渗透法浓缩，然后在一系列离心抽提器中，在介质ｐＨ为１－３的条件下，用水不相溶有机溶剂直接进行逆流提取，同时除去还存留的蛋白质，用水洗涤有机相，从所得有机相中除去水溶性杂质，将有机相在精馏塔中真空干燥至含水量低于０．１体积％，然后蒸发浓缩，用活性炭处理进行脱色，然后将存在于干燥有机相（最宜存在于乙酸乙酯相）的棒酸，通过与Ｎ，Ｎ′－二异丙基亚乙基二胺在大致室温的温度下反应，生成中间体二棒酸Ｎ，Ｎ′－二异丙基亚乙基二胺，而加以分离和提纯，将该中间体分离，然后和２－乙基己酸钾在异丙醇中反应，得到高纯度的棒酸钾盐。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

(IPC C12P 17/18，C07D 498/04)本专利技术属于制药工业领域，涉及从Streptomyces sp.p6621 FERM P2804的发酵肉汤中分离棒酸及其药学上可接受的盐的新的改进方法。技术问题人们始终寻求从产棒酸微生物得到的发酵肉汤中分离制备纯棒酸及其药学上可接受的盐(如棒酸钾)的新的改进方法，在该方法中可避免繁杂的常规分离方法和所需产物的色谱提纯法。现有技术棒酸是下式所示(2R，5R，Z)-3-(2-羟基亚乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂二环〔3.2.0〕庚烷-2-羧酸的俗名， 其碱金属盐和酯是活性β-内酰胺酶抑制剂，这种酶是由某些G+或G-微生物产生的。除了抑制β-内酰胺酶的作用之外，棒酸及其碱金属盐与青霉素类和头孢菌素类β-内酰胺类抗生素合用还具有协同作用。因此，棒酸及其盐被用在盖仑派医学制剂中以预防内酰胺类抗生素的失活。市售制剂含较稳定的棒酸的钾盐(酸单独是相当不稳定的)和阿莫西林三水合物。通过产棒酸微生物的发酵制备棒酸。这些微生物是属于不同的链霉菌属菌株的各种微生物，如S.clavuligerus NRRL 3585，S.iumoninensis NRRL5741，S.katsurahamanus IFO 13716和Streptomyces sp.P 6621 FERM P2804。发酵后得到的水性培养基肉汤可按常规方法提纯和浓缩，例如，在用有机溶剂萃取水溶液以得到不纯的棒酸在有机溶剂中的溶液前，如GB1,508,977所述，进行过滤和色谱提纯。GB1,508,977特别教导，通过将经过滤的肉汤中有棒酸阴离子吸附在阴离子交换树脂上并用电解质从中洗脱下来，将形成的溶液脱盐，然后除去溶剂，从而可得到棒酸的盐。此方法可用来获得可接受量的所需物质，但是它需要用色谱法进行繁杂的提纯，树脂柱的使用需要重要的投资，这限制了大规模的生产操作。GB1,543,563公开了一种使用S.clavuligerus NRRL3585菌株的改良的发酵法，其中培养基的pH值维持在6.3和6.7之间的范围内，从而所需产物的产量增加。通过从棒酸锂再成盐制得棒酸钾等棒酸的盐，从而所需化合物也被纯化了。EP-A-0026044阐述了棒酸叔丁胺盐作为有用的中间体在棒酸制备中的应用。此盐在BE86221中已为人知，但仅作为药物配方中的一种成分。EP-B-0182522公开了一种用微生物S.clavuligerus的发酵制备棒酸的方法。通过在该方法的进程中连续地或间断地加碳源(如甘油)到发酵培养基中来获得方法的重要改进，而非常重要的是将碳水平维持在足够低的浓度，即低于0.5％(w/v)且不能超过2％。实施例阐述了发酵过程中加入碳源时观察到棒酸产量增加的基本改进，阐述了160小时后发酵肉汤中棒酸的浓度为约1400μg/ml，这是对以前方法的重要改进。进一步的改进是棒酸以锂盐形式从溶液中提纯的新方法。但是，为了获得较高纯度的棒酸锂，加入了另一种锂盐(如氯化锂)的浓溶液。用上述文献中已知的方法，可将所得到的重结晶棒酸锂进一步提纯，然后可任意地转变为其它盐，如棒酸钾。用已知的方法，例如离心或过滤，附去菌丝体、蛋白质和其他固体，离心或过滤前用选择的凝聚剂对发酵肉汤进行可能的前处理，使菌丝体凝聚，过滤可能更容易。过滤后的发酵肉汤用离子交换树脂或通过丙酮之类溶剂沉淀，进行进一步处理，以便除去蛋白质，重复离心和过滤，分离沉淀。原存在于发酵肉汤悬浮液中的菌丝体、蛋白质和其它伴随的颗粒的这种分离方法是费时的，需要几道工序。在公开的EP-A-0385552和EP-A-0387178中所揭示的方法中，避免了除去菌丝体、蛋白质和其它悬浮颗粒，接着从所得的透明发酵肉汤中分离以及制备纯的棒酸及其盐的这些费时的方法。整个方法包括三步，即提纯菌丝体、蛋白质和其它固体颗粒的发酵肉汤；用伯胺、仲胺或叔胺形成稳定的棒酸的中间体盐，从Streptomyces clavuligerus肉汤的纯化滤液中提纯以不纯物形式存在的棒酸，从而分出了棒酸中所伴随的大部分杂质；最后一步，将棒酸的中间体胺盐(85％纯度)转变为所需的碱金属盐，如棒酸钾。在EP-A-0385552中，第一步揭示得更详细，其中，用凝聚——絮凝物理化学方法，从微生物Streptomyces clavuligerus发酵所得的水性培养基肉汤中除去菌丝体、蛋白质和其它固体颗粒。在此方法中得到的絮状物足够大，足够紧密，从而可能做到容易沉降和分离，用滚动筛可获得最好的分离。这样即获得透明的肉汤，它还可任选地用反渗透加以浓缩。以这样的方法得到纯化的发酵肉汤，避免了诸如离心、活性炭吸附、与共佐剂一起过滤等常规的提纯方法。在所有已知方法中，还必须，不同于所公开的絮凝方法，用各种去蛋白质和离子交换方法处理经提纯的培养物肉汤，这引起所需物质最终产量明显的总丢失。与公知的方法相反，絮凝方法中总产量为85-95％。所公开的从Streptomyces clavuligerus发酵肉汤凝聚——絮凝的方法基于如下方面将无机电解质加到肉汤培养物中以增加凝聚作用；在搅拌下，在培养基pH值为6-8之间的条件下，应用该无机凝集剂作为凝聚过程的引发剂；在絮凝开始时加入有机电解质；然后用滚动筛或过滤法从发酵肉汤分离所得的絮状物；当絮凝作用发生在水不混溶性溶剂中时，可任选地滗析两相，分离絮状物；及可任选地用反渗透或蒸发来浓缩液体。EP-A-0562583公开了在含棒酸的发酵后形成的水性培养物肉汤进行溶剂萃取后得到的乙酸乙酯萃取物中，用棒酸和有机二胺的盐，如二棒酸N，N′-二异丙基亚乙基二铵，作为有用的中间体，分离和制备纯的棒酸或其碱金属盐，如棒酸钾。技术方案本专利技术的目的是改进从产棒酸微生物，如Streptomyces sp.P6621 FERMP2804，所得的发酵肉汤中分离棒酸的方法，其中避免了除去存在于水性培养物肉汤的菌丝体、蛋白质和其它悬浮固体颗粒的费时的常规方法，然后制备高纯度盐，如棒酸钾。按本专利技术的合适的盐为药学上可接受的碱金属和碱土金属盐，如钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。在这些盐中，钠盐和钾盐，特别是钾盐，最为合适。本专利技术对于借助产棒酸微生物所得发酵肉汤的提纯通常是有用的。从上面的现有技术中显然看出，已知的方法包括费时的分离方法，仅EP-A-0385552公开了一种改进的方法，其中得到完全透明的肉汤。但是，该方法的缺点是为了达到所需目的，必须使用几种试剂，如无机电解质，凝聚剂和有机聚电解质；发酵肉汤的沉降或过滤需要比较长的生产时间，这影响到所需产物的纯度。在第2页第二栏第22-35行，给出了提纯发酵肉汤的一些可能性，但所述方法导致棒酸产量明显降低，还进一步阐述了在分离和提纯过程中几种复杂的技术(如超滤和反渗透)的使用，不能简化方法，因为那些方法的使用需要在活性炭或离子树脂上的前过滤。与这些陈述相反，当按照本专利技术使用微量过滤法时，其中菌丝体、大部分蛋白质(存在于肉汤中的至少80％)和其它悬浮颗粒被除去，令人惊奇地发现，能避免使用EP-A-0385552所公开的方法中使用的几种试剂及该文献中所公开的提纯水性发酵肉汤的其它费时的方法。本专利技术恰当地使用连续微量过滤多级装置，使分离菌丝体和水滤液的过程能在少于半本文档来自技高网...

【技术保护点】
从Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．Ｐ６６２１　ＦＥＲＭ　Ｐ２８０４的水性发酵肉汤中分离棒酸及其药学上可接受的盐的方法，其特征在于：在约２０－４０℃温度和介质ｐＨ５．８－６．２的条件下，用微量过滤法从发酵肉汤中除去菌丝体、大部分蛋白质和其它悬浮固体颗粒，可任选地再用超滤法提纯已提纯过的肉汤（水相），将这样提纯的肉汤用反渗透法浓缩，然后在一系列离心抽提器中，在介质ｐＨ值为１－３的条件下，用水不相溶有机溶剂直接进行逆流提取，同时除去还存留的分离的蛋白质，用水洗涤有机相，在精馏塔中真空干燥至含水量低于０．１体积％，然后蒸发浓缩，用活性炭处理进行脱色，然后将存在于完全干燥的有机相中的棒酸通过与Ｎ，Ｎ′－二异丙基亚乙基二胺在大致室温的温度下进行反应，生成二棒酸Ｎ，Ｎ′－二异丙基亚乙基二铵，而加以分离和提纯，将二棒酸Ｎ，Ｎ′－二异丙基亚乙基二铵分离，然后和２－乙基己酸钾在异丙醇中反应，得到高纯度的棒酸钾盐。２．按权利要求１所述的方法，其特征还在于介质的ｐＨ值用硫酸调节。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：E卡普达，
申请(专利权)人：莱克药物与化学公司dd，
类型：发明
国别省市：SI[斯洛文尼亚]