一种基因定点突变的方法，其特征是选用具有如下结构特点的ＤＮＡ序列作源模板；需突变的位点与一单酶切位点相距１０－２０个碱基；根据该源模板序列设计一个５′端引物和两个３′端引物；两个３′端引物间有１０－２０个碱基的重叠序列，并且其一带有需要在扩增产物中引入的突变序列，另一带有需要在扩增产物中引入的酶切位点；由５′端引物和带有突变序列的３′端引物进行第一轮ＰＣＲ扩增反应，把突变位点引入扩增产物；再以此扩增产物为模板，利用原５′端引物和带有酶切位点的３′端引物进行第二轮扩增，把酶切位点引入到前述带突变位点的序列的３′端；再通过酶切片段的互换，用该序列取代源模板上的相应序列，实现定点突变。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种基因定点突变方法和通过该方法获得的重组细菌5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶基因(aroA)、以及含有此基因的表达载体和转化子。
技术介绍
草甘膦是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜无毒，杂草难以对它产生抗性，低土壤残留量等特点，市场潜力巨大。5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶(E.C.2.5.1.19)，催化植物和微生物中的莽草酸代谢途径倒数第二个反应，使PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)与3-磷酸莽草酸反应生成EPSP(5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸)和无机磷。由于草甘膦具有与PEP相似的结构，可形成EPSP合成酶·S-3-P·草甘膦复合物，阻遏PEP与酶的结合，阻断芳香族氨基酸的的合成，从而杀灭绝大多数的植物，杂草和农作物皆不例外。由于草甘膦可无选择地杀死杂草和作物，因此而制约了它在农业上的应用，使之不能被大规模用于作物的田间除草。然而草甘膦价格便宜，是目前农民最喜用的除草剂。为了适应市场的需要，从二十世纪八十年代中期开始，人们为培育抗草甘膦农作物作了大量的工作。其中最成功的例子是将改良过的草甘膦靶标酶EPSP合成酶导入植物中，以提高转基因植物对草甘膦的抗性。过去采用定点突变法改良EPSP合成酶来降低酶对草甘膦亲和力。由于对酶的三维结构和氨基酸位点的作用并不完全清楚，所以使用定点突变法取得的效果十分有限。以往的定点突变方法遇到的问题是，突变后酶降低了对草甘膦的亲和力的同时对酶原底物的亲和力也下降，因而影响了酶的催化活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基因定点突变方法，采用此方法，可以人为加大发生基因突变的准确性；并运用该方法，把通过基因优化法获得的突变基因作进一步改良，获得活性更高而草甘膦敏感度更低的EPSP合成酶基因并将之用于转基因植物。本专利技术的基因定点突变方法是选用具有如下结构特点的DNA序列作源模板需突变的位点与一单酶切位点相距10-20个碱基；根据该源模板的序列特点，设计出与源模板序列相对应的一个5’-端引物和两个3’-端引物，并采用两步PCR扩增反应，从而得到引入点突变的基因片段。首先，选定要进行定点突变的序列作为源模板，根据该源模板序列设计一个5′端引物和两个3′端引物；重点在两个3’-端引物的设计上。5’-端引物与源模板的5’-端序列相对应，而两个3′端引物问有10-20个碱基的重叠序列，并且其一带有需要在扩增产物中引入的突变序列，另一带有需要在扩增产物中引入的酶切位点序列。由5′端引物和带有突变序列的3′端引物进行第一轮PCR扩增反应，得到引入突变位点的扩增产物；再以此扩增产物为模板，利用原5′端引物和带有酶切位点的3′端引物进行第二轮扩增，把酶切位点引入到前述带突变位点的序列的3′端；最终，获得既带有突变序列，又带有酶切位点的DNA片段。再通过将该片段与源模板上的相应片段进行酶切片段互换，实现基因序列的定点突变。通常，上述本专利技术的基因定点突变方法所用PCR扩增方法的具体条件和操作步骤如下第一步扩增反应反应系统以约102-104拷贝源模板DNA、1×TaqDNA聚合酶缓冲液、4种dNTP各200μmol/L、根据源模板设计的5’-端引物和带有需引入的突变序列的3’-端引物各20pmol以及TaqDNA聚合酶约0.5-5U构成反应系统。反应条件为94℃ 5分钟循环94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循环30次72℃ 10分钟通过琼脂糖凝胶电泳，分离第一步PCR扩增的产物，用作第二步扩增的模板。第二步扩增反应反应系统以约102-104拷贝第一步PCR扩增的产物DNA、1×TaqDNA聚合酶缓冲液、4种dNTP各200μmol/L、根据源模板设计的5’-端引物和带有带有酶切位点的3’-端引物各20pmol以及TaqDNA聚合酶约0.5-5U构成反应系统。反应条件为94℃ 5分钟循环94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循环30次72℃ 10分钟反应完毕，再通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化扩增产物，与源模板分别进行酶切，把带突变序列的新片段，连接到源模板上的相应位置，从而实现定点突变。专利技术人的研究发现，基因优化法能克服定点突变的局限性，增大了发生突变的速度和幅度。若在基因优化法获得的突变基因的基础上，再有目的地进行定点突变，两者相结合，则能减少单纯使用定点突变法的盲目性。因此，上述本专利技术的基因定点突变方法所用的源模板优选通过基因优化方法(参见CN1358858A专利申请)获得的突变基因序列，或者是携带有通过基因优化方法获得的突变基因序列的质粒。按照上述本专利技术的基因定点突变方法，以通过CN1358858A专利申请公开的基因优化方法获得的细菌EPSP合成酶基因aroA-M1(序列表中<210>1序列)作为源模板，并设计出三个与该源模板和点突变要求相对应的引物 引物A5′-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3′引物B5′-CACGTCATCGCTATCCAGCAGATTCATTAATAC-3′引物C5′-GGAATTCCATATGGCGCACGTCATCGCTATCCAGC-3′经两步PCR扩增，最终获得发生了点突变的新基因，命名为aroA-M142。aroA-M142的表达蛋白与aroA-M1基因编码的氨基酸序列相比，在位点42上，发生由蛋氨酸替代苏氨酸的变化。aroA-M1的DNA序列及其表达蛋白的氨基酸序列分别见序列表<210>1和<210>2序列所示；aroA-M142的DNA序列及其表达蛋白的氨基酸序列分别见序列表<210>3和<210>4序列所示。将aroA-M142基因片段插入到质粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位点之间，即可得到含有aroA-M142基因序列的质粒pET-aroA-M142。将aroA-M1基因片段插入到质粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位点之间，即可得到含有aroA-M1基因序列的质粒pET-aroA-M1(该质粒结构参见附图4)。若直接以质粒pET-aroA-M1为源模板，按照与上述以aroA-M1为源模板相同的步骤和条件进行定点突变，则可直接得到带有发生了定点突变的新基因aroA-M142的质粒pET-aroA-M142。将质粒pET-aroA-M142转化大肠杆菌BL-21(DE3)，即可获得命名为BL21(aroA-M142)的转化子。下面通过实施例和附图进一步详细叙述本专利技术附图说明图1pET-aroA-M142质粒结构图；图2aroA-M1基因定点突变为aroA-M142的原理示意图；图3各转化子的蛋白电泳图；图4pET-aroA-M142质粒构建路线示意图；图5转化子在含30mM草甘膦的M9液体培养基中的生长曲线；图6转化子在含60mM草甘膦的M9液体培养基中的生长曲线。具体实施例方式实施例1突变EPSP合成酶基因aroAM142及其表达载体pET-aroA-M142的获得利用前面所述的基因定点突变法，使aroAM1基因序列124-126位置发生ACC→ATG的变化，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何鸣，聂燕芳，徐培林，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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