鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法技术

一种鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体的制备方法，其特征在于：该方法包括①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株→②制备免疫原→③免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠→④融合杂交瘤细胞→⑤筛选杂交瘤细胞→⑥筛选阳性杂交瘤细胞→⑦克隆化→⑧再克隆→⑨制备单抗腹水→⑩测定单抗腹水效价十大步骤，各步骤之间依次连接为先后关系；该方法所制备的菌毛Ｆ１单抗或菌毛Ｐ单抗只与含有Ｆ１菌毛（１７ＫＤ蛋白）或含有Ｐ菌毛（１８ＫＤ蛋白）的鸡大肠杆菌发生反应，而不与其他细菌发生反应，也不与其他大肠杆菌的菌毛发生反应。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物细胞工程
，特别涉及一种。
技术介绍
鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的接触性传染病，是危害养鸡业最严重的传染病之一。鸡大肠杆菌种类繁多，有170多种血清型，但大多数为非致病性，只有极少数是致病菌。其菌毛在致病性大肠杆菌侵入机体，并在机体内定居、增殖、致病的过程中起着重要作用。大肠杆菌菌毛类型很多，且复杂。但对鸡源致病性大肠杆菌来说，目前只发现两种重要菌毛F1和P。两种菌毛均由细菌的染色体编码，其分子量为17KD和18KD，这两种菌毛是鸡致病性大肠杆菌的标志。具有F1菌毛的大肠杆菌可粘附于动物细胞，这种粘附可被D-甘露糖抑制。F1菌毛可与鸡的气管和气囊黏膜的受体结合，构成大肠杆菌入侵的第一步。P菌毛具有红细胞血凝特性，对内脏型和败血型大肠杆菌病起着决定作用。目前国内外对F1和P菌毛进行诸多的研究，但研究受到极大的限制。主要原因是现在研究所用的菌毛抗血清都是多克隆的抗血清，其特异性差，存在着交叉反应，效价低，批次间差异大，制备麻烦，难以推广，不易标准化，不能有效区分F1、P和其他菌毛，满足不了研究的需要。另外大肠杆菌病的防治主要靠疫苗，但目前大肠杆菌疫苗普遍反映效果不理想，归其原因主要是无法筛选优良的制苗菌株，也无法测定其致病性和F1、P菌毛表达的数量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。使用该方法所制备的鸡大肠杆菌菌毛单克隆抗体，应具备特异性强，无交叉反应，效价高，批次间差异小，制备方便，容易推广，容易标准化，能够有效区分F1、P和其他菌毛的特点。本专利技术包括①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株→②制备免疫原→③免疫BALB/C小鼠→④融合杂交瘤细胞→⑤筛选杂交瘤细胞→⑥筛选阳性杂交瘤细胞→⑦克隆化→⑧再克隆→⑨制备单抗腹水→⑩测定单抗腹水效价十大步骤，各步骤之间依次连接为先后关系；本专利技术所制备的菌毛F1单抗或菌毛P单抗只与含有F1菌毛(17KD蛋白)或含有P菌毛(18KD蛋白)的鸡大肠杆菌发生反应，而不与其他细菌发生反应，也不与其他大肠杆菌的菌毛发生反应。所述的步骤①筛选大肠杆菌菌毛表达优良株，将产F1菌毛和产P菌毛的大肠杆菌在改良TSB培养基上37～40℃静置培养40～48h，然后在改良TSB琼脂上37～40℃培养18～24h，挑选单个菌落与常规单因子血清做玻板凝集，筛选菌毛表达良好的菌落，进行连续传代3次；末代培养物离心后，将沉淀用生理盐水悬浮后经磷钨酸染色，电镜观察；当见细菌体周生菌毛，且视野中细菌的菌毛表达良好，作为试验菌种。所述的步骤②制备免疫原，将筛选后菌种用改良TSB培养基在37～40℃静置培养40～48h，用分光光度计测定菌体浓度后，用灭菌生理盐水稀释至6×108～2×109个细菌/ml，0.2％甲醛灭活。所述的步骤③免疫BALB/C小鼠，将灭活抗原与等量弗氏完全佐剂混合，震荡乳化半小时；乳化完全后腹腔注射6～8周龄BALB/C小鼠(0.3ml/只)；2周后用弗氏不完全佐剂同法进行第2次免疫；二免后14天，用灭活抗原腹腔注射免疫鼠(0.2ml/只)，3天后融合。所述的步骤④融合杂交瘤细胞，分别对免疫鼠、用于饲养细胞的ICR小鼠眼球采血并分离血清，作为筛选单抗时的阳性、阴性血清对照。无菌取免疫鼠脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用50％PEG1000融合。所述的步骤⑤筛选杂交瘤细胞，融合后用HAT作为选择性培养基，同时加入饲养细胞，分装在96孔和24孔细胞培养板，置37℃、6％CO2培养箱内培养，7～10天进行观察，有生长的细胞就为杂交瘤细胞。所述的步骤⑥筛选阳性杂交瘤细胞，用全菌包被的间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞；用筛选好的菌毛化程度高的大肠杆菌F1菌毛、P菌毛作包被抗原，包被浓度为8～12×108个细菌/ml，以颗粒性抗原包被法包被酶标板，筛选阳性杂交瘤；对初检阳性的杂交瘤细胞在液氮中保存一份，并同时进行克隆化。所述的步骤⑦克隆化，采用稀释法进行克隆化，再按上述的步骤⑥进行检测，阳性克隆细胞在液氮中保存一份，一份进行再克隆。所述的步骤⑧再克隆，按步骤⑦克隆化进行，对分泌抗体进行特异性鉴定，(详见表1、表2)以建立具有稳定分泌特异性抗体能力的克隆株；再克隆的阳性细胞在液氮中保存一份。所述的步骤⑨制备单抗腹水，将经降植烷处理的BALB/C小鼠，腹腔内注射鉴定后再克隆的杂交瘤细胞，注射量为5×105个细胞，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清备用。所述的步骤⑩测定单抗腹水效价，(1)ELISA效价包被同步骤⑥，抗原为完全菌毛化的菌株，浓度为8～12×108个/ml，将所获得的Y1、Y2腹水单抗倍比稀释，与包被抗原间接ELISA，测定腹水效价；(2)试管凝集价分别将Y1腹水单抗倍比稀释，与浓度为1.5～3×109个/ml已菌毛化的大肠杆菌做试管凝集反应，测试管凝集价。使用本专利技术还涉及到鸡大肠杆菌菌毛培养提纯技术和单克隆抗体的特异性鉴定。A、鸡大肠杆菌菌毛培养提纯技术1)F1菌毛的提取菌毛的提取是采用Hide等的方法，略加改进。大肠杆菌C600在MD液体培养基上传代2次，经电镜观察菌毛表达充分后扩大培养于5000mlMD液体培养基；37℃培养48小时后，4500r/min离心细菌培养物，将菌体沉淀用200mlPBS悬浮，在60℃水浴锅中轻轻震荡20分钟，然后在磁力搅拌器上快速搅拌15分钟，8000r/Min离心20分钟，吸出上清，加等量饱和硫酸铵沉淀菌毛。4℃过夜后以6000r/min离心20分钟；沉淀用3mlPBS悬浮，-20℃保存备用。2)P菌毛的提取P菌毛的提取是采用Hide等的方法，加以改进。简述如下大肠杆菌C1976-79在TSB液体培养基上传代2次，经电镜观察苗毛表达充分后扩大培养于5000mlTSB液体培养基；37℃培养48小时后，4500r/min离心细菌培养物20分钟，将菌体沉淀用200ml PBS悬浮，在60℃水浴锅中轻轻震荡20分钟，然后在磁力搅拌器上快速搅拌15分钟，8000r/min离心20分钟，吸出上清，加等量饱和硫酸铵沉淀菌毛。4℃过夜后以6000r/min离心20分钟；沉淀用3ml PBS悬浮，-20℃保存备用。B、单克隆抗体的特异性鉴定1)F1菌毛单抗的特异性鉴定表1、抗F1菌毛的单抗(Y1)与大肠杆菌、沙门氏菌的凝集排谱反应菌株 血清型 与单抗反应性y1参考菌株C600 O1F1+++++C1214-77 O6K2H1F1a\b++++已知F1+鸡致病性大肠杆菌株1 O103F1++++2 O11F1++++3 O30F1++++4 O115F1++++5 O78F1++++6 O131F1++++猪源致病性大肠杆菌C83901O8K87K88ab-C83907O149K91K88ab-UP001 O8；K87；K88ab-C83539O141K99-C83707O101K30F41-8199 O101F18acH4-107/86O139K12F18acH7-沙门氏菌株S.typhinu -S.newport -S.enteritidis -S.anatum-S.Newington - S.seftrnberg -S.Aberdeen -2)P菌毛单抗的特异性鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜元钊，董国雄，范根成，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：