在植物中从蛋白片段重构靶蛋白的方法技术

本发明专利技术披露一种能够在靶宿主，如一种植物内高效表达蛋白质的新型转基因系统，又能避免经花粉将这种转基因带入相关的宿主系统和／或环境。该方法同样适用于真核细胞生物（酵母、昆虫、哺乳动物细胞等）和原核生物（如大肠杆菌等）内任何目的蛋白（如一种毒性蛋白）的表达。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是国际申请日为2000年5月23日，国际申请号为PCT/US00/14122，名称为“产生能够表达活性蛋白产物的断裂、不可传递的基因的方法”的中国专利申请No.00807542.5的分案申请。
技术介绍
过去的几年中，由于转基因农作物的出现使美国的农业发生了一场革命，这些转基因作物能抵抗特定的疾病、昆虫及除草剂，或者其营养价值得到改善。与此同时，人们又更多地担心这些基因修饰的农产品对其消费者产生损害，并且这些转基因可能被转移到相关的植物品系中，甚至形成对昆虫或除草剂抵抗的“超级种子”(Ferber，D.科学Science2861662(1999))或被其他微生物消耗后造成损害(Losey等，自然Nature399214(1999))。但是目前几乎没有对担心“转基因”食物有害的科学依据，转基因被转移到其它植物并且对生态产生负面效应的可能性并非完全没有根据(Bergelson等，自然Nature39525(1998))。这种转移可通过密切相关的种属传粉，或者通过病毒或质粒载体将基因片段转入不相关的植物，这些病毒或质粒载体的转移可通过植物相关真菌、细菌或昆虫介导。已经讨论过预防转基因传播的几种技术，然而这些方法要么象一连串构建物一样，被设计成对新的杂交植物有负面影响(Gressel，TrendsBiotechnol.，17361-366(1999))，要么不能排除通过水平基因转移进行传播的可能性(Bertolla和Simonet，Res.Microbiol.，150375-384(1999))。在本专利技术中，我们介绍一种新型的转基因方法，能够高效表达蛋白质而不需要基因复制过程并且极少有机会通过水平基因转移进行传播。专利技术概要本专利技术公开了一种能够在靶宿主，如一种植物，内高效表达蛋白质的新型转基因系统，同时又能避免通过花粉将这种转基因带入相关的宿主系统和/或环境。这里描述的方法同样适用于真核细胞生物(酵母、昆虫、哺乳动物细胞等)和原核微生物(如大肠杆菌等)内任何目的蛋白(如一种毒性蛋白)的表达。在每一种情况下，目标基因至少被分裂成两个片段，每一片段都能与intein编码序列的一部分融合。每一融合基因以无活性蛋白形式表达，并且这些独立表达的融合蛋白被重新拼装成一个活性形式。这些基因片段的区室化使得目标蛋白在所希望的部位重新组合，能防止将功能基因转移至其他微生物。需要指出的是，尽管本专利技术主要针对农业和植物生物技术的实施例，但该方法应用范围十分广阔，可用于任何微生物中任何基因表达，防止基因意外地转移到其它微生物中去。附图详细说明附图说明图1A-蛋白剪接机理。蛋白剪接是翻译后过程，该过程涉及从具有侧向N末端和C末端区域(exteins)连接的蛋白前体切割内部蛋白片段，即intein。序列排列显示在两个剪接结合点处存在高度保守的残基intein N末端有一个半胱氨酸或丝氨酸残基，intein的C末端有His-Asn，extein的C末端处有Cys，Ser或Thr作为第一残基。这些保守的剪接连接残基直接参与催化肽键断裂和蛋白剪接反应的连接作用。N末端有半胱氨酸残基和与之C末端相连的intein剪接的化学机理如图1所示步骤1-在intein的N末端对cys1的N-S acyl重排，形成一个线性硫酯中间产物；步骤2-在步骤1形成的硫酯上intein C末端形成后，迅速用Cys攻击进行酯化，形成分支状的中间产物；步骤3-在intein C末端Asn残基上通过肽键断裂同时伴有琥珀酰亚胺的形成来切除intein；步骤4-短暂形成的连接物自动进行s-N Acyl重排，从硫酯变成稳定的氨基键。其他intein的剪接过程除图1所示的Cys残基可能被Ser或Thr替代外，都类似于上述4个化学步骤。因此，步骤1到4分别为N-O和O-N酰基的转换。图1B-蛋白剪接的卡通画图2-反式剪接。图2A-intein片段的N末端和C末端与两个为融合N-extein和C-extein序列的剪接结合的相互关系。推测这种剪接反应是通过如以前介绍的同样的顺式剪接通路来完成的。图2B-可选择的是，在无剪接时，intein能通过随后酶活性的产生而促进两个extein序列的连接。这被称之谓intein介导的互补作用。图3-Ssp DnaE intein基因在集胞藻属PCC6803中的排列。蓝-绿海藻集胞藻属PCC6803基因组包含断裂的dnaE基因，该基因在745kb位点有多个片段存在。天然的反式剪接的intein与两个基因产物片段融合形成一个活性聚合酶。图4A-断裂靶基因。用融合在C末端和N末端区域的部分intein基因能将靶基因分裂成两个片段。这些断裂基因可被置入植物染色体内以便下述表达重新进行。图4B-转基因的内容。将目的基因，此处是指一种除草剂抗性基因，分裂成两个片段(靶N和靶C)，并将一种intein(INn和INc)融合到每个片段基因内。两个融合基因单独放置在基因组的远端位置上。一个基因可能在叶绿体内，而另一个基因可能在核基因组内。叶绿体内的转基因在叶绿体内发生转录和翻译，而核内的转基因在细胞核内转录，在细胞浆内翻译。核基因翻译完毕后在叶绿体转运肽的协助下被转运进入叶绿体，在叶绿体内它可利用intein作为连接或剪接成分与其他基因片段相互联系。图5-大肠杆菌菌株ER2744内乙酰乳酸合酶(ALS)的反式剪接。靶基因被intein片段(INn和INc)分裂，表达成两种无活性的蛋白质。在宿主细胞内蛋白的反式剪接能产生一种活性靶蛋白。图6-乙酰乳酸合酶(ALS)基因的排序(SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ IDNO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46)。大肠杆菌乙酰乳酸合酶II(ALSII)的空白区域用下划线表示。箭头表示大肠杆菌乙酰乳酸合酶II的断裂位点。星状标志代表玉米ALS的断裂位点。图7-平皿实验显示ALSIIm-14使大肠杆菌ER2744对缬氨酸和除草剂产生抵抗，SM.大肠杆菌ER2744细胞用表达ALSII蛋白(1)、ALSIIm(2)、ALSIIm-14(3)的质粒DNA进行转化，并置于在含0.3mMIPTG，100ug/ml缬氨酸(a)，或100ug/ml缬氨酸和50ug/ml SM(b)M9培养基的平皿中。平皿实验在30℃条件下进行50小时。图8-通过SSp DnaE intein介导的反式剪接产生重组ALSIIm-14。用表达质粒转化而来的细胞作为对照(泳道1)，ALSII(泳道2)，ALSIIm(N)-INn(泳道3)，ALSIIm(C)-INc(泳道4)，ALSIIm(N)-INn和ALSIIm(C)-INc(泳道5)，2ul细胞提取物在12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移到一张S&S硝基纤维素膜上，用抗ALSII N末端(图8A)或ALSIIC末端(图8B)抗体探查。(图8C)反式剪接的效率是温度敏感性的，用抗ALSIIm N末端抗血清进行Western杂交。从表达质粒转化的细胞中制造蛋白提取物，成为含有与以下抗血清反应的非特异蛋白的大肠杆菌提取物对照(泳道1)，ALSII(泳道2)，ALSIIm(N)-INn和ALSIIm(C)-INc(泳道3-6)，这些。本文档来自技高网...

【技术保护点】
在植物中从蛋白片段重构靶蛋白的方法，包括：ａ）将编码靶蛋白的基因断裂成至少两个ＤＮＡ片断；ｂ）通过将步骤ａ）中的ＤＮＡ片断分离以抑制基因向其它植物传送，其中至少一种编码靶蛋白一部分的ＤＮＡ片段被区室化进入细胞核中，编码靶蛋白 另一部分的其它ＤＮＡ片段被区室化进入叶绿体；ｃ）在植物中表达步骤ｂ）中的ＤＮＡ片断，以产生相应的靶蛋白片段；ｄ）在植物中从蛋白片断重构靶蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐明群，TC埃文斯，S普拉丹，DG科姆，H保卢斯，L孙，陈立新，I高希，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，波士顿生物医学研究所，
类型：发明
国别省市：US[美国]