重组过敏原肌动蛋白结合蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了重组过敏原肌动蛋白结合蛋白及其制备方法。本发明专利技术从葎草或／和豚草花粉中提取总ＲＮＡ，以总ＲＮＡ为模板，根据生物信息学数据设计通用简并引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ获得肌动蛋白结合蛋白的５′基因片段；再合成肌动蛋白结合蛋白基因特异性引物，采用ｃＤＮＡ末端快速扩增技术获得肌动蛋白结合蛋白基因的３′基因片段；利用５′及３′基因片段从而获得基因全长；然后将基因克隆入ｐＥＴ－４４原核表达载体中，转化ＢＬ２１（ＤＥ３），进行蛋白质的表达；接着采用亲和层析的方法对目标蛋白进行纯化，从而获得纯的肌动蛋白结合蛋白。本制备方法具有表达量高，生产稳定，成本低的特点。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体的说涉及重组蛋白及其制备方法。
技术介绍
变态反应性疾病是人类常见的自身免疫性疾病，其危害极大且极难根治，同时，其与过敏人群所生存的外界环境密切相关。据相关报道，变态反应性疾病的发病率在30％以上，并且有随着城市化及工业化进程的推进而不断增多的趋势。自然界的过敏原种类繁多，分布广泛。作为空气过敏原的植物花粉，不仅其本身的危害人类无法规避，而且不同植物花粉之间以及植物花粉与其它类型的过敏原之间都存在着交叉反应，这样就使得过敏人群始终处于过敏原包围之中。花粉过敏原有其普遍性。花粉过敏原的种类繁多，花粉以气溶胶的形式存在，并随着空气流动，可以使相当范围的过敏人群受害。研究表明几乎所有发生量较大的花粉都有其过敏人群。花粉过敏原普遍性的另一方面来自交叉反应(cross-reactivity)的发生。具体表现在不仅不同种属的植物花粉过敏原之间可以发生交叉反应，而且不同科目的植物花粉过敏原间也能发生交叉反应，甚至花粉过敏原与食物过敏原之间也可以发生交叉反应。这样就组成了一个强大的过敏原网络，使得过敏性体质人群总是处于过敏原包围状态之中，极其容易引发过敏症。一般地，在花粉大量开散季节，根据病人的典型病史、症状与体征来对花粉过敏症作出非特异性诊断。对于特异性诊断，早期较多依赖于花粉浸提液穿刺皮肤试验所得的结果，但是，由于阳性结果仅能说明患者存在对该类花粉过敏的可能，因此确诊率并不高。相比较而言，根据病人血清中特异性IgE(sIgE)的含量进行诊断，其准确率却相对较高。免疫治疗法是过敏性疾病的最佳治疗方案，该方法首见报道于1911年，其后广泛采用而流传至今。但是，传统的免疫疗法依赖于花粉浸提液，由于其成分复杂而且无法进行标准化定量，存在诸多缺点，如见效慢，需要病人长期坚持，有诱发过敏的危险等等，从而使其应用受到了一定的限制。相比较而言，重组过敏原的产量高，生产条件稳定，方便进行过敏原的标准化，利于临床诊断和治疗，因此对重组过敏原基因的研究正呈现急剧增长的态势，并成为变态反应学的研究热点。具有广泛的交叉反应性的过敏原蛋白质通常被称之为泛过敏原。大量过敏原基因的获得为揭示过敏原交叉反应的分子机理提供了基础平台。研究表明虽然同种植物花粉过敏原之间存在高度的异质性，但是，同种过敏原基因之间却存在高度的相似性，而同科不同属种植物花粉过敏原之间也享有一些共同的结构特征。正是由于花粉过敏原之间保有共同的结构特征，特别是IgE结合表位的相似性，才构成了交叉反应发生的分子生物学基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述问题及天然花粉过敏原浸提液行脱敏治疗的不足，从过敏原基因的全长cDNA出发，通过基因工程的手段，合成重组过敏原肌动蛋白结合蛋白，用于研制一种具有广谱性治疗作用的重组花粉泛过敏原疫苗，以归避天然提取物的非单一性及标准化难的障碍，应用于一类变态反应特应性人群，以降低疫苗的变应原性而提高免疫原性，缩短治疗周期，从而替代花粉浸提液。本专利技术的另一个目的在于提供该重组过敏原肌动蛋白结合蛋白的制备方法。本专利技术所获得的重组过敏原肌动蛋白结合蛋白的氨基酸序列如图1所示，其制备方法如下所示(1)从花粉中提取总RNA；(2)合成引物Sg1p55′-ATGTCGTGGCAGGCGTACGT-3′，Sg1p35′-CCTCTCAACAA(T/G)CA(C/T)GTTGCATTG TCC-3′；(3)以上述总RNA为模板，通过RT-PCR获得重组过敏原肌动蛋白结合蛋白的5′基因片段；(4)设计引物PD105′-GGAGCTGTGATTCGAGGGAAAAAGG-3′以及PD035′-CTGCATCAAGAAAACAGGCCAAGC-3′；进行重组过敏原肌动蛋白结合蛋白的5′基因片段的cDNA末端扩增，获得肌动蛋白结合蛋白基因的3′基因片段，(5)利用5′及3′基因片段获得全长基因；(6)将所得全长基因的开放阅读框与原核表达载体酶切连接，构建重组质粒载体； (7)将所得重组质粒载体转化宿主菌；(8)培养经转化的宿主菌并诱导其表达重组过敏原肌动蛋白结合蛋白；(9)纯化重组过敏原肌动蛋白结合蛋白。上述步骤(1)所述的花粉为葎草或/和豚草花粉。上述步骤(3)所述的PCR过程的退火温度为45～72℃。上述步骤(6)所述的原核表达载体为pET-44。上述步骤(6)所述酶切的酶切位点为EcoRI和PstI。上述步骤(7)所述的宿主菌为BL21(DE3)。上述步骤(8)是采用IPTG诱导经转化的宿主菌表达重组过敏原肌动蛋白结合蛋白的上述步骤(9)是采用亲和层析的方法对重组过敏原肌动蛋白结合蛋白进行纯化。本专利技术的有益效果本专利技术从过敏原基因的全长cDNA出发，采用基因工程的方法，合成了重组过敏原肌动蛋白结合蛋白，所得重组蛋白纯度高，治疗效果好，可用于制备一种具有广谱性治疗作用的重组花粉泛过敏原疫苗，以降低疫苗的变应原性而提高免疫原性，缩短治疗周期，从而替代花粉浸提液。同时本制备方法具有表达量高，生产条件稳定，成本低的特点，方便进行过敏原的标准化，有利于临床的诊断和治疗。附图说明图1为重组过敏原肌动蛋白结合蛋白氨基酸序列图； 图2为重组过敏原肌动蛋白结合蛋白D106诱导表达及纯化电泳图；图3为重组过敏原肌动蛋白结合蛋白D03的诱导表达及纯化电泳图；图4为重组过敏原肌动蛋白结合蛋白LCM9的免疫印迹结果图；图5为重组过敏原肌动蛋白结合蛋白LCS13的免疫印迹结果图；图6为重组过敏原肌动蛋白结合蛋白D03的免疫印迹结果图。其中，在图2中，M为蛋白分子量标准(218-6.8kD)；第1泳道，经IPTG诱导，在约14kD处有一新条带，与第2泳道不经IPTG诱导明显不同，纯化后，得到一条带；图3中，M为蛋白分子量标准(97-14.4kD)；第1泳道，IPTG诱导表达的蛋白纯化后，得到一条带，氨基酸测序为预期蛋白。具体实施例方式实施例1、基因克隆a)按照Invitrogen公司的TRIZOL Reagent说明书，从豚草花粉中提取总RNA。b)从SWISS-PROT及TrEMBL21(http//www.expasy.org)、NCBI的GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)等数据库取得花粉过敏原序列数百条，以CLUSTAL W(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行序列对比和聚类，以聚类后各大簇中的主要亚簇的代表性过敏原之cDNA序列为基础，设计引物Sg1p55′-ATGTCGTGGCAGGCGTACGT-3′；Sg1p35′-CCTCTCAACAA(T/G)CA(C/T)GTTGCATTGTCC-3′，以总RNA为模板，通过RT-PCR获得肌动蛋白结合蛋白的5′基因片段，PCR过程中的退火温度为45～72℃。其中所说的主要亚簇的代表性过敏原是指在聚类过程中优先聚类的过敏原，即以对齐后的顺序排列聚类结果时，排在每一亚簇的最里层的过敏原。c)依据所得基因序列设计特异引物PD105′-GGAGCTGTGATTCGAGGGAAAAAGG-3′以及PD035′-CTGCATCAAGAAAACAGGCCAAGC-3′，采用cDNA末端快速扩增技术获得肌动蛋白结合蛋白基因的3′基因片段。本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组过敏原肌动蛋白结合蛋白，其氨基酸序列如图１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何韶衡，陶爱林，
申请(专利权)人：汕头大学医学院，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]