利用腺苷脱氨酶制备双脱氧肌苷的方法技术

一种制备双脱氧肌苷（ｄｄＩ）的方法，包括以下的步骤：（ａ）获得表达ｄｄＡ脱氨酶活性的酶；（ｂ）将酶固定到不溶的支持物上；（ｃ）于产生ｄｄＩ溶液的时间内和条件下使酶与双脱氧腺苷（ｄｄＡ）溶液接触，所述双脱氧腺苷溶液的浓度至少为在水中的约４％重量体积；以及（ｄ）从ｄｄＩ溶液中分离ｄｄＩ。任选地，将产生的ｄｄＩ母液再利用于后续的程序中以改良产率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体涉及从2′，3′-双脱氧腺苷(ddA)制备2′，3′-双脱氧肌苷(ddI)的方法，更具体地，本专利技术涉及利用源自人类ADA核苷酸序列的腺苷脱氨酶(ADA)制备ddI的方法。
技术介绍
的描述双脱氧核苷是相对稳定的核苷类似物。双脱氧核苷2′，3′-双脱氧肌苷(ddI)已展示有作为抗病毒剂的有用的药理学活性。Hartman，etal.，Clin.Pharmacol.Ther.47647(1990)。具体地，ddI已展示可单独使用或联合3′-叠氮基-2′，3′-双脱氧胸苷(AZT)治疗爱滋病。随着人类免疫缺陷病毒AZT抗性菌株的产生，ddI的利用越来越重要在实验室内合成双脱氧核苷的努力已有报道，例如在2′或3′位置的核苷的脱氧。Chem.Pharm.Bull.，22128(1974)。然而，在通常需要用来驱动反应的温度以及pH条件下，由于空间阻碍及核苷的不稳定，化学合成是困难的。此外，用于合成的起始材料是昂贵的，并且不可大量供应。到目前为止，无法按比例增加实验室合成双脱氧核苷的规模至此类化合物工业规模的商业化生产。已知可以用多种方法通过腺苷脱氨酶由双脱氧腺苷(ddA)的酶促脱氨作用进行工业规模的ddI生产。已报导利用牛腺苷脱氨酶使2′，3′-双脱氧腺苷脱氨基，从而合成ddI。Webb et al.，Nucleosides& Nucleotides，7(2)147-153(1988).亦有报导利用牛腺苷脱氨酶按比例放大合成ddl的过程，包括溶剂以及缓冲液等参数的优化。Nucleosides & Nucleotides，10(7)1499-1505(1991)。Farina等的美国专利No.5,011,774号公开了一种方法，其中(D)-2′，3′-双脱氧腺苷的端基异构混合物在有利ddl更具活性的β端基异构体酶促脱氨的速率的适当的溶剂内与ADA反应。此方法使用的市售ADA源自小牛脾脏。这个方法避免了分离出不需要的α-端基异构体所需的层析以及结晶技术的步骤。然而，利用此方法可能的缺点是当用牛来源的酶时，有传播传染性海绵状脑病(TSE)的危险。Yokozeki等的美国专利No.4,970,148公开了一种方法，其中将2′，3′-双脱氧腺苷(ddA)与含有能将ddA转化为ddI的ADA酶的微生物培养液接触。此方法使用全部微生物、细胞匀浆物、或溶菌酶、盐、表面活性剂等处理的细胞产物的培养液做为ADA的来源。此方法的一个缺点是酶的天然来源在超过8的pH下是固有不稳定的，并且要求严格的pH控制。当在小于8的pH下进行时，产物ddI仅在非常稀的浓度(重量体积＜1％)下是可溶的。结果此方法每批产生非常少的ddI。此外，如此产生的ddI必须进行广泛的纯化步骤以去除残留的蛋白质污染物以获得纯化的ddI产物。此类纯化步骤是昂贵的，并且可导致产物的损伤以及降低产量。Noguchi等的日本专利申请No.5-219978公开了生产核酸相关物质例ddI的方法，包括克隆编码适当酶的基因，构建具有导致此基因高表达的调控序列的表达载体，用此表达载体转化微生物以形成转化体，诱导克隆基因的表达，以及提取和分离如此表达的酶。然后用分离的酶和适当的起始材料例如ddA反应，产生所需要的核酸相关物质。与Yokozeki专利相比，此方法产生的可用的酶量增加100倍。然而，依据此方法分离的酶是微生物酶。因此，至少对于ADA，此酶在pH值大于8时缺少稳定性。结果，为了获得可接受的产量，必须严密调控pH。此外，此方法产生的产物和ADA紧密接触。反应混合物受到杂质例如未反应的ddA、核酸副产物以及ADA和产物的污染。因此，必须进行广泛的纯化方法从反应混合物中分离ddI。该纯化方法典型地需要重复的液相层析或薄层层析。此类纯化步骤不易用于商业性的规模放大。Yokozeki等的美国专利No.4,962,193公开了由采用酶的方法纯化ddI的方法，其中使用多孔的、非极性树脂吸附ddI到树脂上，分离树脂与溶液，并且分级洗脱吸附的ddI以获得纯化的产物。然而，此方法在最终纯化步骤之前要先经前处理以去除蛋白质和浓缩物并且过滤含产物的溶液。因此，此方法既昂贵且耗时。因此目前需要一种工业规模的方法来制备ddI，该方法提供令人满意的产率而无传播TSE的危险或无须进行广泛的纯化程序以去除残留蛋白质，而且使用在宽的pH范围稳定的酶。专利技术概述本专利技术总体涉及通过使ddA与固定在不溶的支持物上的具有ddA脱氨酶活性的酶接触而制备ddI的方法。本专利技术提供制备双脱氧肌苷(ddI)的方法，包括以下的步骤(a)获得表达ddA脱氨酶活性的酶；(b)将酶固定到不溶的支持物上；(c)于产生ddI溶液的时间内和条件下使酶与双脱氧腺苷(ddA)溶液接触，所述双脱氧腺苷溶液的浓度至少为在水中的约4％重量体积；以及(d)从ddI溶液中分离ddI。任选地，将产生的ddI母液再利用于后续的程序中以改良产率。专利技术详述本专利技术涉及以经济和可靠的方式从ddA制备ddI的方法，其可避免现有技术的方法的缺点。以前从ddA制备ddI的方法包括利用市售的ADA，例如牛ADA(可购自Sigma)或源自培养用微生物ADA转化的大肠杆菌的ADA。此方法包括在溶液中混合酶和ddA，将ddA转化成ddI。接着，必须从含各种污染物，包括酶的溶液中移出ddI。这要求大量纯化和分离以从污染的反应混合物中获得ddI。与现有技术的方法相反，本专利技术使用ADA，或其它能使ddA脱氨基的固定化状态的酶。固定化有利于改进酶在反应混合物中的稳定性。更重要的，固定化允许从反应混合物中容易地分离ddI终产物，因为主要的污染物，即酶保持固定于不溶的支持物上。本专利技术进一步提供新的ADA来源。在本专利技术的优选实施方案中，是利用使人ADA或其保守衍生物转化的生物生长而获得的ADA，从ddA制备ddI。本专利技术方法的优点之一是人ADA在更宽的pH范围内比微生物的ADA更稳定。当反应在超过大约8的pH下进行时，ddA保持稳定且改进了转化为ddI的效率。其它优点是在这些pH下ddI比pH低于大约8时更易保持在溶液内。产物ddI在高pH值(＞8)下改进的溶解度的特性可使反应在更高的浓度下进行，由此改进ddI的产率。本专利技术方法利用固定于不溶的支持物上的人类ADA酶或者具有ddA脱氨酶能力的其它酶。本专利技术是利用由所述固定化导致的酶的稳定性改进的优点。因此，可在典型地变性或以其它方式干扰酶活性的pH范围下进行从ddA产生ddI的反应。此外，固定ADA给ADA赋予了方便的特性，即，经简单过滤方法从反应产物分离酶的能力。制备腺苷脱氨酶(ADA)本专利技术特别感兴趣的ADA是人类ADA或其保守变体，其具有氨基酸序列SEQ ID NO1(Genebank编号gi114043373)。选择此人类形式的ADA是由于它比微生物来源的ADA有更优越的结构稳定性。特定言的，与微生物的ADA相比，人类ADA在相对宽的pH范围内维持显著的活性。此外，与微生物的ADA相比，人类ADA在升高的温度下对降解更具抗性。人类ADA的DNA序列公布为源自人类mRNA的cDNA序列，它是1,533个碱基的序列。参阅Gwendolyn，S.et al.，Mol.andCell本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备２′，３′－双脱氧肌苷（ｄｄＩ）的方法，其包含以下步骤：（ａ）获得表达ｄｄＡ脱氨酶活性的酶；（ｂ）将此酶固定至不溶的支持物上；（ｃ）于产生ｄｄＩ溶液的时间内和条件下使酶与双脱氧腺苷（ｄｄＡ）溶液接触，所述双脱氧腺苷溶液的浓度至少为在水中的约１％重量体积；及（ｄ）从ｄｄＩ溶液分离ｄｄＩ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：PM斯科内兹尼，M波利蒂诺，SW刘，AW博伊尔，JG陈，GL斯泰因，T弗兰西施尼，WL安德逊，
申请(专利权)人：布里斯托尔迈尔斯斯奎布公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]