无脊椎动物来源的促性腺激素及其制备方法技术

本发明专利技术阐明了无脊椎动物（海燕）的促性腺激素的结构。该促性腺激素是一种由两种亚基组成的肽，其分子量为４５００至４９００；在该肽的结构中，这两种亚基通过其所含半胱氨酸中的ＳＨ残基间的二硫键连接起来。可以通过合成这两种亚基，并将它们进行混合和氧化获得具有性腺刺激活性的肽（促性腺激素）。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及来源于无脊椎动物(如海燕(Asterina pectinifera)等)的促性腺激素及其制备方法。
技术介绍
有两种脊椎动物促性腺激素控制生殖腺的发育以及卵子和精子的发育、成熟和释放。对于来源于脊椎动物(如鱼等)的促性腺激素的说明已有相当大的进展。这些激素结构上的相似性从鱼到人都得到了很好的保留，这些激素是具有包含α亚基和β亚基的异二聚体结构的蛋白质激素。脊椎动物促性腺激素被证实对脊椎动物具有种间促性腺刺激效应(非专利文献1，专利文献1和2)，但对无脊椎动物不具有此效应。对无脊椎动物促性腺激素的阐释还没有对脊椎动物促性腺激素的阐释那样充分。促性腺激素(GSS)提取自海燕(即，无脊椎动物)的辐神经，并被证实能促进卵巢产卵(非专利文献2和3)。据报告，促性腺激素促使卵巢中围绕在卵子周围的卵泡细胞合成并分泌直接作用于卵子的卵母细胞成熟诱导激素(1-甲基腺嘌呤)(非专利文献4)。专利文献1JP 2967945专利文献2JP H06-107689非专利文献1日本比较内分泌学协会编，“Biological Science ofHormone 5，Hormone and Reproduction(II)”，日本科学协会出版社，pp.41-47，1979 非专利文献2日本动物学会编，“Problems in Modern Zoology 4，Oocytes and Sperms”，东京大学出版社，pp.21-37，1975非专利文献3Shirai H.，Gonad-Stimulating andMaturation-Inducing Substance，″Method in Cell Biology″AcademicPress，vol.27，pp.73-88，1986非专利文献4Mita M.& Nagahama Y.，Involvement of G-proteinsand adenylate cyclase in the action of gonad-stimulating substance onstarfish ovarian follicle cells，Developmental Biology，1991，144，262-8专利技术要解决的技术问题由于促性腺激素具有促进成熟的效应，因此它们对于活生物体养殖是重要的。本专利技术是基于对无脊椎动物促性腺激素的结构的突破性阐释，并可望应用于无脊椎动物(例如虾、蟹、贝类等)的养殖。解决问题的方法本专利技术人成功地对海燕神经细胞分泌的性腺刺激激素的结构进行了分析。专利技术人首次阐明了促性腺激素是一种分子量为4500至4900的肽，包含分子量为2000至2400和2400至2600的亚基，该结构由两种亚基中所含半胱氨酸的SH残基间形成的二硫键组成，并证实通过两种合成亚基的混和与氧化所获得的肽具有性腺刺激活性。本专利技术人所分析的结果开启了广泛应用的新的可能性，使激素的大量生产等成为可能。也就是说，本专利技术涉及包含以下两种肽的无脊椎动物来源的促性腺激素，其中两种肽的6个半胱氨酸之间形成二硫键(a)一种肽，其具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，或在所述氨基酸序列中除第4和16位氨基酸(Cys)外包含一或几个氨基酸(即2至3个)的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有性腺刺激活性； (b)一种肽，其具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，或在所述氨基酸序列中除第10、11、15和24位氨基酸(Cys)外包含一或几个氨基酸(即2至3个)的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有性腺刺激活性。另外，本专利技术涉及通过混合和氧化以下两种肽而制备的无脊椎动物来源的促性腺激素(a)一种肽，其具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，或在所述氨基酸序列中(优选除Cys外的氨基酸中)包含一或几个氨基酸(即2至3个)的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有性腺刺激活性；(b)一种肽，其具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，或在所述氨基酸序列中(优选除Cys外的氨基酸中)包含一或几个氨基酸(即2至3个)的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有性腺刺激作用。这两种肽是基于以无脊椎动物性腺刺激活性作为指标，通过纯化(a)取自无脊椎动物的神经器官，或(b)被报道具有性腺刺激活性的某种器官而获得的。此外，本专利技术涉及用于制备具有性腺刺激活性的肽的方法，该方法包括混合和氧化上述两种肽。这两种肽可通过任何方法获得，即，它们可通过化学合成或通过基因工程获得。本专利技术涉及编码上述两种肽((c)和(d))中的任一种的DNA。肽提取自宿主或培养基，其中所述宿主由含有上述两种DNA的载体转化，并在培养基中培养和生长。具有性腺刺激活性的肽可通过混合和氧化所述肽制备。此外，本专利技术涉及DNA，其含有编码上述两种肽((c)和(d))的DNA，并与SEQ ID NO3的核苷酸序列具有超过70％的相同性。具有性腺刺激活性的肽可通过培养和生长由含所述DNA的载体转化的宿主制备。另外，肽可提取自宿主或所述宿主的培养基，其中所述肽可被混合和氧化。附图说明图1为显示性腺刺激活性的标准的照片。右侧显示产生了卵子且存在性腺刺激活性。图2表示纯化促性腺激素的高效液相层析图谱。图3表示纯化促性腺激素的高效液相层析图谱。图4表示纯化促性腺激素的微剂量高效液相层析图谱。图5表示纯化促性腺激素的微剂量高效液相层析图谱。图6显示通过质谱仪对纯化的促性腺激素(异源二聚体)进行分析的结果。图7显示通过质谱仪对促性腺激素的亚基进行分析的结果。图8表示纯化合成的促性腺激素的高效液相层析图谱。专利技术详述本专利技术的无脊椎动物来源的促性腺激素基因的DNA序列包含SEQ ID NO3的核苷酸序列(351个碱基)、编码上述两种肽((c)和(d))的DNA，或与SEQ ID NO3的核苷酸序列具有超过70％的相同性的核苷酸序列。人类基因组组织的人类基因分析计划的报告(Science 2001，291(5507)，1304-1351)提出通过计算机程序(Otto system)在基因组序列中自动进行基因注释的标准，其中基于与已知遗传信息的多核苷酸序列的相同性确定基因组的基因区域的标准应为超过92％的相同性。该报告还提出了用于搜索通过基因复制而扩增的基因组的70％的多核苷酸相同性标准(之后的进化可能引起基因突变，并可能伴有核苷酸序列的部分改变)。因此，与本专利技术中的SEQ ID NO3具有超过70％，优选超过92％的相同性的核苷酸序列可用作无脊椎动物促性腺激素基因，其被应用于相近但不同的动物物种中。本专利技术的无脊椎动物促性腺激素的氨基酸序列包含SEQ ID NO4中所示的116个氨基酸，或所述氨基酸序列中有一或几个(例如2至3个)氨基酸(优选除Cys外的氨基酸)的缺失、取代或添加的氨基酸序列。在氨基酸序列(SEQ ID NO4)中，从第1位氨基酸甲硫氨酸(M)到第29位氨基酸甘氨酸(G)的序列为信号序列，从第30位氨基酸谷氨酰胺(E)到第48位氨基酸丝氨酸(S)为亚基A(GSS-A)，从第49位氨基酸赖氨酸(K)到第92位氨基酸精氨酸(R)为亚基C(GSS-C)，从第93位氨基酸丝氨酸(S)到第116位氨基酸半胱氨酸(C)为亚基B(GSS-B)。本专利技术的无脊椎动物促性腺本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含以下两种肽的无脊椎动物来源的促性腺激素，其中在两种肽的６个半胱氨酸之间形成二硫键：（ａ）一种肽，其具有ＳＥＱＩＤＮＯ：１的氨基酸序列，或在所述氨基酸序列中除第４和１６位氨基酸外包含一或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸 序列，并具有性腺刺激活性；（ｂ）一种肽，其具有ＳＥＱＩＤＮＯ：２的氨基酸序列，或在所述氨基酸序列中除第１０、１１、１５和２４位氨基酸外包含一或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有性腺刺激活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：长滨嘉孝，吉国通庸，三田雅敏，矶部稔，
申请(专利权)人：大学共同利用机关法人自然科学研究机构，国立大学法人名古屋大学，学校法人帝京大学，
类型：发明
国别省市：JP[日本]