本发明专利技术公开了一种使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术。本发明专利技术的使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术是利用无脊椎动物没有特异抗体反应的特性，用噬菌体浸泡水产无脊椎动物幼体或亲本，浸泡后，从水产无脊椎动物幼体或亲本采集培养样本，再将噬菌体从水产无脊椎动物体内分离，再浸泡，反复多次进行连续浸泡，同时对噬菌体进行培养选择，最后得到在水产无脊椎动物体内长期存活的噬菌体。采用本发明专利技术技术所得到的噬菌体无毒无害，在水产无脊椎动物体内可长时间保持对宿主菌裂解活力，同时还可以满足水产无脊椎动物幼体与亲本的生产需要，为防治水产无脊椎动物弧菌病提供了新的技术。?
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种使水产无脊椎动物幼体与亲本携带菌体的技术，具体为一种使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术，属于水产微生物领域。
技术介绍
人类医学上，利用噬菌体及其裂解酶，特定蛋白质作为控制耐药菌株的工具之一。 噬菌体作为抵抗病原宿主菌的有力工具在水产上得到应用，可以采取水体投放的方式，或者创口涂抹，口服，以至于浸泡等方式。在水产应用中，除利用水体投放有效降低宿主致病菌的浓度外，在水产动物体内的预防和治疗实际上主要依赖于浸泡、口服的方式，其对肠道病原菌有良好的抑制效果，但是对体内血液的致病菌的效果变差。在动物感染病原体时，1小时内浸泡使用噬菌体，保护率达到100%，感染时间延长，再使用噬菌体效率下降，到24小时后，保护率下降到48% (C R Merril, B Biswas, R Carlton, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 April 16; 93(8): 3188 - 3192)。在水产上，要在感染病原菌数小时内及时投放噬菌体，有较大难度。因此长期保持生物体内有足够量的噬菌体，在预防疾病上有重要意义。噬菌体在动物体内存活时间短，在人体体内不超过Mh，即使在鱼等低等脊椎动物体内，一般也不超过48h。因此一直没有有效方式，保证噬菌体及时杀灭病原宿主菌，有效保护养殖动物。水产无脊椎动物幼体培育中，密度大，水体变化也大，因此，弧菌病害严重；同样， 亲本培育过程时间长，相对而言，养殖环境不能及时更新，弧菌病害也严重干扰，因此制作在养殖期动物体内长期存活的噬菌体将有利于长期防御宿主菌，也有利于长期保持水体中相当量的噬菌体浓度。这种体内长期存活的噬菌体对于具有特定抗体体液免疫的脊椎动物，将会引发免疫反应，影响动物生长和生存能力，但是对于特异性免疫反应不同的无脊椎动物，没有致病能力的噬菌体大多数情况下不会严重影响道该无脊椎动物生长和生存能力。C R Merril 等人在其发表的文章(C R Merril, B Biswas, R Carlton, N C Jensen, G J Creed, S Zullo, and S Adhya. Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 April 16; 93(8) : 3188 -3192.)中，为防治多重细菌病原耐药性研究了长循环噬菌体，其中，对大肠杆菌coli和伤寒沙门氏菌噬菌体，他们利用一种连续通道(serial-passage)技术在鼠体内选择能够在长周期内保留于循环系统内的噬菌体变异体，其研究表明在25h时，与对照组比较，血液中噬菌体保留浓度高4-5个数量级。1998年Adhya，Sankar L. Carlton, Richard Μ.， Merril, Carl R.申报美国专利(U. S，Patent，5811093) “Bacteriophage genotypically modified to delay inactivations by the host defense system，，,对这类大肠杆菌coli 和伤寒沙门氏菌噬菌体在细菌浸染的宿主防御系统失活(减少数量，减低裂解活性)的非遗传工程技术的连续通道(serial-passage)技术申报专利。2005年Christal L. Vitiello, Carl R. Merril, Sankar Adhya ( Virus Research, 114 (2005) 101 _ 103)发文认为是该噬菌体突变导致衣壳蛋白的一个氨基酸变化引起其在血液中循环周期的变化，λ噬菌体浸泡鼠后Mh，比一般多13，000 - 16，000倍保留于血液中，Capparelli等人在2007年用 Sia/^j^ococciAs atfreiAs 的噬菌体观察到相似的结果(Ant. Agents. Chem. 51 (8): 2007,2765-2773)o 2009 ^Ξ Joas L. Da Silva; Rosario D. C. Hirata; Mario H. Hirata 等(Braz. J. Microbiol. 40 (3) :1517_8382，2009)再一次认为这种技术对目前状况特别是医院感染是适用的。利用噬菌体抑制水产动物宿主病原菌，已经有多个专利。专利200710078116. 7利用多种噬菌体处理净化环境病原菌，其中包括霍乱弧菌，副溶血弧菌；专利200910038392. X分离副溶血弧菌噬菌体并用以杀菌，用于水体环境，包括养殖环境；专利申请号 201110050243. 2分离哈维氏弧菌，利用分离得到的病原菌进行噬菌体的分离，防治刺参腐皮综合症。上述研究和专利技术专利，在脊椎动物中长循环噬菌体强化了保护效果和延长了时间，但是对于水产动物而言，并不适用。以浸泡噬菌体方法，不适合于规模化养殖的水产产业；噬菌体在体内存活的时间还是不能满足要求，水产动物(如对虾)要求数十日，以至于终生(如贝类)保持在体内保持噬菌体，并一直保持对宿主菌的裂解活性，这种类似于“活体疫苗”的噬菌体，将可以有效控制细菌性疾病。但是这有必要的条件需要满足，即噬菌体对养殖动物无害或低害，不影响生长，养殖动物对该噬菌体低水平免疫反应，噬菌体在体内可以保持对宿主菌的裂解性。本专利技术涉及的弧菌噬菌体产生很低毒素水平，无脊椎动物没有以抗体为基础的特异性免疫反应，奠定了本专利技术的基础。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术，采用该技术可得到无毒无害的噬菌体，且所得到噬菌体在水产无脊椎动物体内可长时间保持对宿主裂解活力，同时还可以满足水产无脊椎动物幼体与亲本的生产需要。为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案是一种使水产无脊椎动物幼体与亲本无害携带弧菌噬菌体的技术，包括如下具体步骤(1)从养殖水体按常规分离弧菌属菌株及其噬菌体，得到噬菌体裂解液；(2)将步骤(1)获得的噬菌体裂解液经离心回收，0.22Mffl滤膜过滤后，用双平板法测效价，得到浓度为1.5 X IO11 8. 5 X IOltlPfVml的噬菌体液，于4°C保存，作为保存液，备用；(3)将步骤(2)获得的保存液以蛋白胨水稀释，以双平板法计数，得到浓度为 0.8 X IO9 1. 5 X IO9 pfu/mL的噬菌体液，作为浸泡使用液；(4)第一次浸泡将步骤(3)获得的浸泡使用液投放于养殖海水中，使浸泡使用液终浓度为IXlO6 IXlO7 pfu/ml，然后向养殖海水中加入水产无脊椎动物幼体或亲本，浸泡 0. 5 2h，为第一次浸泡；(5)第二次浸泡第一次浸泡后第7天时，采集培养样本，用双平板法涂布平板，裂解宿主菌株，选取噬菌斑，分离噬菌体，利用该噬菌斑制作与第一次浸泡的浸泡使用液同等浓度的噬菌体使用液，并在养殖海水中投放与噬菌体使用液同样浓度的本步骤制作得到的噬菌体，用另一组水产无脊椎动物幼体或亲本作第二次浸泡，浸泡0. 5^2h ；(6)以与第二次浸泡同样的方式进行连续多次浸泡，并进行噬菌体的培养选择，但从第二次浸泡开始，将采集本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邱德全，邱明生，杨世平，王成桂，申玉春，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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