提供了由乙醇腈酶促生产乙醇酸的多种方法。这些方法包括：１）利用具有改善的用于将乙醇腈转化为乙醇酸的腈水解酶活性的敏捷食酸菌７２Ｗ腈水解酶突变体，和２）改善催化剂稳定性和／或生产率的方法。该改善催化剂稳定性和／或生产率的方法包括利用反应稳定剂，在基本上无氧的条件下运行反应以及控制反应混合物中底物的浓度。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】乙醇酸的酶促生产本申请要求都于2004年12月22日提交的美国临时申请第 60/638,176和60/638,127号的权益。专利
本专利技术涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地说，提供了一种 使用具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶，由乙醇腈酶促生产乙 醇酸的方法。专利技术背景乙醇酸(HOCH2COOH; CAS登记号为79-14-1)是羧酸的a-羟基酸家 族的最简单成员。其特性使之理想地广泛用于消费和工业用途，包括用 于水井修复、皮革工业、油气工业、洗衣和纺织工业、在聚乙醇酸(PGA) 制备中作为单体、以及作为个人护理产品成分。在多个行业中，乙醇酸 还是的清洁剂的主要成分(乳制品和食品加工设别清洁剂、家用和机构用 清洁剂、工业清洁剂、以及金属加工)。最近，已报道聚乙醇酸作为阻气性材料(即 显示高阻氧特性)用于包装食品及汽水(WO 2005/106005 Al)。然而，乙醇酸的传统化学合成产生了大量的杂质，在用于制备作为阻气性材料的 聚乙醇酸之前必须除去。商业化生产乙醇酸的新技术，特别是一种以高 纯度及低成本生产乙醇酸的技术，将是工业上所渴望获得的。已知多种使用相应的a-羟基腈作为原料以及微生物作为催化剂用 于制备a-羟基酸的方法。所产生的a-羟基酸的例子包括乙醇酸、乳酸、 2-羟基异丁酸、2-羟基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羟基-3,3-二甲基-4-丁内 酯和4-曱硫丁酸。这些产物是使用微生物合成的，例如属于诺卡氏菌属 (AAocanikz)、 芽孑包杆菌属(5acz'〃w力、短杆菌属(Srevz力ac/^n.ww)、 金4干菌 属(^4wreo6a"en'ww)、 々支单i包菌属(尸sew(iomowa力、 享L酪4干菌属 (0^eo^"er)、 产减軒菌属(^4/ca/扭we力、不动軒菌属(^4"力柳Z "c^)、 肠4干菌属(五"/^ro6acfer)、 节#干菌属(/4w/zro6"cfer) 、 i矣希氏4干菌属 、 微球菌属(Mjctococcws)、 链霉菌属(5Yr，omyce力、黄杆 菌属(FAxvoZ)a"e"'謂)、 气单胞菌属(Jerowo"—、 枝动軒菌属 (綺cop/"m )、纤维单月包菌属(0〃w/omo"oy)、欧文氏菌属C&w/ma)、 ，I丝 酵母属(Q/"Wtfo)、 无芽孑包杆菌属(Sa"enV/z'i/附)、曲霉属(^4s/ grgz'〃i^)、 青 霉属(尸ew/c/〃z.wm)、 S走孑包月空菌属(C0c/2/z'060/ws)、 镰孑包菌属(Fz^"n.t/m)、纟工 假单胞菌属(朋otiop化W(icw7o"—、 红球菌属(i /zo6fococc—、 棒状軒菌属 (Co^ywe6aCerz'wm)、纟田^干菌属(Mz.cro6ac,erz.ww)、 (9Z^wm6acfen'wm和戈登 氏菌属(Gonfo"a)的那些微生物(相应于US 5, 223,416的JP-A-4-99495、 JP國A-4-99496和JP-A國4國218385;相应于US 5,234,826的JP-A-4誦99497; 相应于US 5,296,373的JP-A-5-95795; JP-A-5-21987;相应于US 5,326,702 的JP-A陽5-192189;相应于EP画A画0610048的JP-A-6-237789;相应于 EP-A-0610049的JP-A-6-284899;相应于US 5,508,181的JP-A-7國 213296)。然而，大多数已知的上述由相应的a-羟基腈制备a-羟基酸的方法并 不产生并以足够高的浓度积聚产物，以满足商业上的需要。经常的结果 是在反应初期酶就失活。US 5,756,306教导了 "当使用腈水解酶或腈水合 酶酶促水解或水合a-羟基腈以产生a-羟基酸或a-幾基酰胺时，所出现的 问题是在短时间内酶失活。因此，难以以高浓度和高产率获得a-羟基酸 或a-羟基酰胺"(第1栏，第49-54行)。维持反应混合物中醛浓度(由a-幾基腈解离为醛和氰化氢所形成的)和/或a-羟基腈浓度在规定的范围内 是一种避免该问题的方法。US 5,508,181提出了涉及酶快速失活的更多困难。特别是，U.S. 5,508,181提及根据解离平衡，a-羟基腈化合物部分解离为相应的醛。这 些醛通过与蛋白结合，在短时间内失活酶，因此;f艮难由a-羟基腈以高产 率获得高浓度的a-羟基酸或a-羟基酰胺(第2栏，第16-29行)。阻止由 于醛积聚所引起的酶失活的解决方案是将磷酸盐或次磷酸盐离子添加 到反应混合物中。US 5,326,702使用亚硫酸盐、二亚硫酸盐或连二亚硫 酸盐离子来螯合醛并阻止酶失活。然而，即使通过使用上述这样的添加 剂，所产生和积聚的a-羟基酸的浓度仍然是不高的。U.S. 6,037,155教导了 a-羟基酸产物的低积聚与由于解离的醛积聚 所引起的短时间内酶失活相关。这些专利技术人提出在水中a-羟基腈部分解 离所产生的氰4b氢04g"'cw/Z^ra/ Sz'o/ogz'ca/ C7zew^/T7， Vol. 46, pages 1165 (1982))以及相应的醛或酮(C/ze脂ca/Vol. 42, pages 189 (1948)) 存在下，酶活性受抑制。本专利技术人通过使用微生物解决了醛诱导的活问题，所述微生物酶活性能通过将氰化物添加到反应混合物中而得到 改善。氰化物的添加限制了 a-羟基腈解离为醛和氰化氢。具体就乙醇酸生产来说，已知乙醇腈能可逆解离为氰化氢和曱醛，两者都可失活酶活性。US 3,940,316描述了一种由相应的腈制备有机酸 的方法，使用了具有"腈水解(nitrilasic)"活性的细菌，并列出乙醇腈作为 底物。具体来说，该专利描述了对于该目的使用芽孢杆菌属、无芽孢杆 菌属、微球菌属和短杆菌属细菌。虽然被描述具有腈水解活性，但是短 杆菌R312C8reWk "enww A3W)是在US 3,940,316所有实施例中使用的 唯一菌抹。已知短杆菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但没有腈水 解酵;舌'l"生(Toumeix等，Jwfowz.e 丄eewwew/20eA:， 52:173-182 (1986》。一种通过利用属于纟奉状杆菌(Coo^e^c"n'wm s/^.)的微生物制备乳 酸、乙醇酸和2-羟基异丁酸的方法披露于日本专利/>开号昭61-56086 中。JP 09028390披露了 一种通过红球菌属或戈登氏菌属水解酶起作用， 由乙醇腈制备乙醇酸的方法。报道了对乙醇酸的选择性几乎为100%, 没有乙醇酸酰胺生成。US 6,037,155披露了由a-羟基腈产生包括乙醇酸 的a-羟基酸的方法的例子。该/>开内容承认由于前述问题之故并非所有 的微生物催化剂都能产生高浓度的乙醇酸，并教导应当进行筛选研究以 便发现在工业上有益的微生物。US 6,037,155具体鉴定了抗a-羟基腈或 a國鞋基酸4中制效应的 r"novorajc 和节4干菌(jw/ztoZ^"w )孩支生物，具有持久的活性，并能在高浓度下产生期望的产物。敏捷食酸菌(JcWm;orajc /a"fe)72W(ATCC 5574本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种由乙醇腈生产乙醇酸的方法，包括： ａ）将适合的含水反应混合物中的乙醇腈与包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂接触，所述多肽具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代： （１）在氨基酸残基第１６８位用赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代；和 （２）在氨基酸残基第２０１位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代； 由此产生乙醇酸；和 ｂ）以盐或酸的形式回收（ａ）中产生的乙醇酸；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌７２Ｗ腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化剂提供了至少１．５倍腈水解酶活性的增加。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R迪科西莫，MS佩恩，A帕诺瓦，DP奥基夫，JS汤普森，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：US[]
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