一种快速筛选具有吸附特性的多环芳烃降解菌的方法技术

本发明专利技术涉及微生物修复的技术领域，具体为一种利用吸附性载体筛选多环芳烃降解菌株的新方法。本发明专利技术的根据是多环芳烃的特性：四环或四环以上的大分子多环芳烃水溶性很低，极易吸附在固体颗粒物上，而在这些颗粒物表面的微环境中可能含有利用多环芳烃的降解菌。本发明专利技术的目的是提供一种可以快速、高效筛选具有吸附特性的多环芳烃降解菌的方法。本发明专利技术利用吸附性载体培养分离降解菌，利用双层平板技术进行初筛，最终根据降解效率筛选降解菌株。初筛和复筛相结合，大大提高了筛选效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及污染土壤的微生物修复
，具体为一种利用吸附性载体筛选多环芳烃降解菌的新方法。
技术介绍
多环芳烃是一大类环境有机污染物，具有致癌、致畸、致突变的作用，其中有16种被美国环保署列为优先污染物。消除多环芳烃的污染，对于改善环境、提高人民生活质量有很重要的意义。环境中的多环芳烃主要靠微生物降解，所以筛选高效降解菌是多环芳烃污染土壤生物修复技术的一个关键。目前，传统的方法是采用液体摇瓶培养法筛选降解菌株。这种方法的主要缺点是仅筛选到在悬浮液体中快速生长的微生物类群，具有吸附能力的降解菌很难筛选到，而污染环境中污染物大都吸附在固体颗粒物上。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种真实可靠、快速高效筛选多环芳烃降解菌的方法。本专利技术的技术方案是，结合多环芳烃水溶性很低、极易吸附在颗粒物上的特性，利用吸附性载体富集多环芳烃降解菌，采用双层平板法进行初筛，并用高效液相色谱技术测定其对多环芳烃的降解效率，最终筛选到高效降解菌。1、污染土壤样品的采取和预处理采取0-20cm深度土壤样品，过1mm筛，4℃保存。2、利用吸附性载体富集及分离降解菌在三角瓶内添加吸附性载体，其加入量以遮盖住三角瓶底部为宜(10-20g)，用纱布包好，于121℃，湿热灭菌20分钟。将1mg/mL的多环芳烃丙酮溶液50uL喷洒在载体上，静置2h，使丙酮自然挥发，最后加入40mL无机盐培养基和10mL土壤悬液，30℃避光摇床培养。每10天取3～4g载体转接到新鲜配制的含载体的无机盐液体培养基中。30天后将载体取出，用无菌水冲洗掉土壤颗粒和非吸附的菌体，置于以多环芳烃为唯一碳源的含制霉菌素的无机盐固体培养基平板上，30℃培养4～6天。将载体周围菌苔刮下，在上述平板上划线分离单菌落，斜面保存。其中，吸附性载体可以为改善土壤质地常用的珍珠岩、稻壳等。土壤悬液的制备如下称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠的用量以充满瓶底为最好)，振荡5～10分钟，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。无机盐液体培养基的组成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸馏水中；pH 7.0±0.2；含载体的无机盐液体培养基的具体组成如下在三角瓶内先添加吸附性载体，其加入量以遮盖住三角瓶底部为宜(10-20g)，用纱布包好121℃湿热灭菌20分钟；待其冷却后，将1mg/mL的多环芳烃丙酮溶液50uL喷洒在载体上，静置2h，使丙酮自然挥发，然后加入50mL无机盐液体培养基。以多环芳烃为唯一碳源的含制霉菌素的无机盐固体培养基平板的组成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸馏水中，加入20g琼脂；pH 7.0±0.2。分装在4个500mL的三角瓶中，每个三角瓶装250mL培养基于121℃湿热灭菌20分钟。倒平板时，每个三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素，0.25mg多环芳烃并摇匀。所用的多环芳烃可以为菲，芘，荧蒽，苯并芘等。3、降解菌的初筛采用双层平板法进行降解菌的初筛。双层板下层为无机盐固体培养基，上层为多环芳烃唯一碳源无机盐固体培养基。接菌于双层板上，30℃培养6-10天，在紫外灯下观察，若多环芳烃被降解，则该菌落周围培养基在紫外光下的吸收减弱，表现为菌体周围产生有非曝亮的暗圈。其中，无机盐固体培养基的组成为K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸馏水中，加入20g琼脂；pH 7.0±0.2。多环芳烃唯一碳源无机盐固体培养基的组成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸馏水中，加入20g琼脂；pH 7.0±0.2。分装在4个500mL的三角瓶中，每个三角瓶装250mL培养基于121℃湿热灭菌20分钟。倒平板时，每个三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素，0.25mg多环芳烃并摇匀。4、降解菌的复筛将初筛降解菌株接入以多环芳烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中培养10天，过滤收集菌体，用无菌水洗涤菌体2次，用新鲜配制的无机盐液体培养基调节菌体浓度为OD660＝0.3，取1mL菌悬液接入装有9mL无机盐液体培养基的培养瓶中，培养瓶预先加入1mg·mL-1的多环芳烃丙酮溶液10uL，如菲、芘、苯并芘等，并将丙酮挥发掉，培养基中多环芳烃的最终浓度为1mg·L-1。30℃避光摇床培养10天，培养基中剩余的多环芳烃采用高效液相色谱(HPLC)方法测定。最终选取降解率高的菌株作为高效降解菌。其中，多环芳烃唯一碳源的液体无机盐培养基的组成为K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸馏水中，加入20g琼脂；pH 7.0±0.2。分装在4个500mL的三角瓶中，每个三角瓶装250mL培养基于121℃湿热灭菌20分钟。倒平板时，每个三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素，0.25mg多环芳烃并摇匀。无机盐液体培养基的组成为K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸馏水中。本专利技术的根据是多环芳烃的特性四环或四环以上的大分子多环芳烃水溶性很低，极易吸附在固体颗粒物上，而在这些颗粒物表面的微环境中可能含有利用多环芳烃的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速筛选具有吸附特性的多环芳烃降解菌的方法，其特征在于：结合多环芳烃水溶性很低、极易吸附在颗粒物上的特性，利用吸附性载体富集及分离多环芳烃降解菌，采用双层平板法进行初筛，并用高效液相色谱技术测定其对多环芳烃的降解效率，最终从污染土壤中筛选到高效降解菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，王荣，任瑞霞，徐慧，李慧，史荣久，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]