本发明专利技术首次公开了花生中一种细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣａｓｅ）基因的核苷酸序列及其所编码的蛋白质序列。本发明专利技术还提供了该花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ＡｈＰＥＰＣ５的克隆方法。本发明专利技术基因ＡｈＰＥＰＣ５的核苷酸序列与花生中植物型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列存在明显差异。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于脂肪酸代谢工程领域，具体涉及花生PEPC家族中编码的一种 细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法。
技术介绍
细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPCase是高等植物、细菌、蓝细菌和 绿藻中广泛存在的一种胞质酶(Chollet等，1996),它能催化C02和磷酸烯醇 式丙酮酸(PEP)形成草酰乙酸(OAA)，是C4植物光合固定C02的关键酶。 同时，PEPC ase在柠檬酸循环、调控细胞内pH值以及阳离子平衡等方面也具 有重要作用(潘瑞炽等，1995 )。在植物中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是具有 几种同工酶形式的小家族。在高等植物中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有植物型 和细菌型之分。植物型PEPC酶和细菌型PEPC酶的区别在于，植物型PEPC 酶在N端存在比较保守的磷酸化区(Ser残基)，保守区序列为XX-SIDAQLR, 而细菌型PEPC没有(SAnchez et a1，2003 )。拟南芥中鉴定了四个PEPC基因， 其中Atppcl, Atppc2和Atppc3是植物型，而Atppc4基因编码了一种细菌型 PEPC酶(Sdnchez et a1,2003 )。同时，大豆中也获得了五个PEPC基因，其中 GmPEPCl， GmPEPC4， GmPEPC7和GmPEPC16基因编码植物型PEPCs,而 GmPEPC 17编码细菌型PEPC (Sullivan et al.,20(H)。由此推测，细菌型PEPC在 植物中是普遍存在的，它可能发挥特定的作用。本专利技术首次从花生中分离获得 了细菌型PEPC酶基因AhPEPC专利技术内容本专利技术的目的在于公开花生PEPC家族中一种编码细菌型的磷酸烯醇式丙 酮酸羧化酶基因(AhPEPC5)的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列。同时，本 专利技术还要提供该磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆方法。本专利技术所提供的花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，它来自花生(Arachis hypogaea),命名为爿/2尸五尸C5基因，核苷酸序列如SEQ IDNO: 1所示。上述一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因编码的蛋白质，它来自花生 (Arachishypogaea),命名为AhPEPC5蛋白质，其氨基酸序列SEQ ID NO: 2所 示。上述花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(^zi^户C5)的克隆方法，包括如 下步骤(1) 选用Ell花生种子置于研钵中，室温下加入0.5ml植物RNA提取试 剂(可使用天为时代公司的RNAplant试剂)，充分研磨后，转移至1.5mlEP 管中，振荡至彻底混匀，抽提总RNA,用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量， 然后在分光光度计上测定RNA含量；(2) 根据已经扩增的花生AhPEPC5部分序列(2983bp),设计引物 GSP1:5- CATGTCCACAATCCCTGCCTGCCTC -3 (如SEQ ID NO: 3所示) GSP2:5- GACGGCGGAGAAGTTTGTGCTGGTG -3 (如SEQ ID NO: 4所示)以获得的总RNA为模板，经反转录合成5，-RACE-Ready cDNA和 3，-RACE-Ready cDNA，用高保真Taq酶进行PCR扩增。5，-RACE的PCR程序如下94。C预变性4min， 94。C变性30s, 65。C复性 30s， 72。C延伸2min， 30个循环后,72°C 15min;3'-RACE的PCR程序如下94。C预变性2min, 94。C变性30s, 65。C复性 30s, 72。C延伸2min, 27个循环后，72°C 15min;PCR产物回收后克隆至pMD 18-T Simple载体，委托上海生工生物技术有 限公司测序后获得AhPEPC5的5'端序列和3'端序列。(3) 根据已经获得的AhPEPC5基因的5'端序列和3'端序列，设计两端引物fPEPC5: 5'- CGGCTCGTATGTTGTGTGGAATT -3'(如SEQ ID NO: 5所示) fPEPC3: 5'- TAATGGGGATAGGTGGAAACTGG -3'(如SEQ ID NO: 6所示) 以步骤(2)获得的5'-RACE-Ready cDNA为模板，用高保真Taq酶进行 PCR扩增，PCR程序如下94。C预变性4分钟，9fC变性45s, 57。C复性50s, 72。C延伸3min30s， 30个循环后，72°C 15min，最终将PCR产物进行克隆、测 序获得了花生细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的全长cDNA序列。具体实施方式 实施例1下面结合具体实例对本专利技术作进一步详细的描述。选用花生品种Ell的种子(不多于0.1克)于研钵中，室温下加入0.5ml 植物RNA提取试剂(天为时代公司的RNAplant试剂)，充分研磨，转移至1.5mL EP管中，振荡至彻底混匀，抽提总RNA,用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量， 然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，经反转录合成 5，-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA,利用RACE技术获得了磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶基因的5'端序列和3'端序列。根据磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶基因的5'端序列和3'端序列设计两端引物fPEPC5: 5'- CGGCTCGTATGTTGTGTGGAATT -3'(如SEQ ID NO: 5所示) fPEPC3: 5'國TAATGGGGATAGGTGGAAACTGG -3'(如SEQ ID NO: 6所示)采用RT-PCR方法进行cDNA克隆，PCR反应程序为9fC预变性4分钟， 94。C变性45s, 57。C复性50s， 72。C延伸3min30s, 30个循环后，72°C 15min， 最终将PCR产物进行克隆、测序获得了花生细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基 因的全长cDNA序列。本专利技术的AhPEPC5全长3375bp,其第一个开放阅读框位于19-3129处。 DNAssist软件分析表明AhPEPC5共编码1036个氨基酸。通过NCBI的CDD(conserved domain database)对AhPEPC5的功能结构域进行搜索，发现其氨 基酸序列含有两个大的PEPC活性位点，分别位于151 162氨基酸位点和 694~706氨基酸位点。利用花生AhPEPC5基因部分序列设计引物，釆用实时荧光定量PCR方法， 对花生AhPEPC5基因在花生种子、根、茎和叶四种不同组织中的转录表达情 况进行了分析。发现AhPEPC5基因在花生的叶和根中表达量较高，在种子和 茎中的表达量较低。上述实施例表明本专利技术中克隆的花生细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AhPEPC5 ),是首次从双子叶植物花生(Arachis hypogaea)中分离获得。mRNA 表达分析表明，AhPEPC5基因在检测的花生不同组织中都有不同程度的表达。SEQUENCE LISTING<110>山东省花生研究所<120> <130> 082672 <160> 6< 170> Patentln version 3.5<210> 1&l本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种花生中细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ＡｈＰＥＰＣ５，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈明娜，迟晓元，闵平，潘丽娟，杨庆利，禹山林，朱凤，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。