构建抗黄瓜花叶病毒的转基因植物制造技术

本发明专利技术为一种用基因工程技术构建新型的抗黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）转基因植物的方法及基转基因产物。将ＣＭＶ外壳蛋白基因和ＣＭＶ卫星ＲＮＡ基因同时引入植物染色体中，获得再生植株，该两种基因在转基因植物中都得到表达。该方法适用于茄科，十字花科和葫芦科等双子叶植物。（*该技术在2011年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为用基因重组技术构建抗黄瓜花叶病毒(CMV)感染的转基团植物的制备方法及转基因产物，更具体的说，本专利技术涉及构建CMV-JV株外壳蛋白基因，将外壳蛋白基因和卫星RNA基因同时整合到转移载体中，构建出能同时表达这两个转基因产物的方法及转基因产物。CMV能引起属于85科，365属的755种植物病害，是我国危害最严重的病害之一。由于在大多数植物中未找到抗CMV因子，加之其又属非持久性蚜虫介体传染，难于进行治蚜防病，故无有效的防治办法。自从发现致弱病毒的卫星RNA和外壳蛋白可用于植物病毒的防治，已有许多报导用植物基因工程的方法获得抗病毒的转基因植物，证实了外壳蛋白(CP)基因和卫星RNA(Sat)基因的抗病作用。EP-279433号专利公布了CMV-Y株外壳蛋白的基因，用于产生抗CMV感染的植株的方法。美国尼普约翰公司从CMV-C株得到了外壳蛋白基因，构建转化载体，在植株中表达(W08905858)。另一种制备抗CMV转基因植物的方法是将卫星RNA基因引入植物染色体中，以获得抗性基因。CMV具有三分段基因组(RNA1，RNA2，RNA3)和一个为外壳蛋白编码的亚基因组(RNA4)，此外有些CMV中含有第五种分子量为1.1×105D的小分子RNA(卫星RNA)。卫星RNA不能独立复制，但能干扰病毒复制，改变寄主植物中症状的表达，并往往引起症状的减弱，卫星RNA已用于生物防治(田波等，科学通报，31(6)475，1986)。Baulcombe等报道将卫星RNA-1-17N的cDNA引入烟草，转化植株产生了对CMV的抗性。田波领导的实验室报道用CMV卫星RNA-1构建抗CMV的转基因烟草和番茄(吴世宣等，中国科学B辑，1989，9948-956.赵淑珍等，中国科学B辑，1990，7708-713.)，具有对CMV侵染的抗性;含有外壳蛋白基因的抗性植株产生抗病毒侵染的早期抗性，晚期效果不明显，而卫星RNA产生抗病毒复制的晚期抗性。转单基因的植株，只在不同时期以不同特性表现出各自不同的抗性，对完全防治病毒都有一定的局限性。本专利技术的目的在于提供一种转基因植物的方法，在转基因植物中能同时表达卫星RNA和外壳蛋白基因，产生高抗性的植株。本专利技术的另一目的是提供带有上述两种基因的嵌合基因的转基因产物。本专利技术的主要特征是把具有病毒早期抗性的外壳蛋白基因和病毒晚期抗性的卫星RNA基因构建在同一载体上，一起引入植物中。两个基因各自带有自己的表达盒，转基因产物能同时表达外壳蛋白和卫星RNA。从感染CMV卫星RNA-1的烟草叶片中提取卫星双链RNA作为模板，合成全长的卫星RNA-1互补DNA，得到含卫星RNA-1cDNA的克隆pUI(张春霞等，科学通报34(7);540，1989)。该克隆含有附图说明图1的卫星RNA-1基因。外壳蛋白基因的合成以极强株CMV-JV为材料，接种烟草，两周后采集病叶，提纯病毒，从纯化的病毒提取病毒RNA作为反转录的模板，用3′端及5′端两个引物进行全长CP序列cDNA的合成。其引物序列为3′-引物5′-TCAGACTGGGAGTACTCT-3′5′-引物5′-ATGGACAAATCAAA-3′在3′端引物引导下，反转录合成第一条cDNA链。碱解模板RNA链，再加入5′端引物，合成第二条cDNA链，并以T4DNA聚合酶除去伸出的3′端以获得平端双链cDNA。将合成的CP的双链cDNA连接到E.coli质粒pUC19，转化大肠杆菌。在T4多核苷酸激酶的作用下标记3′引物的5′端，并以此作为探针。菌落杂交筛选出阳性克隆，经酶切筛选出插入片段大小在0.7kb左右的阳性克隆，测定插入片段序列，所得的CP序列如图2。以ROKⅡ为中间载体构建含有上述两个基因的表达载体。ROKⅡ是由Binl9衍生而来的，其结构如图3所示。它含有T-DNA的左右边界序列，花椰菜花叶病毒35s启动子，蓝曙红合成酶转录终止序列，在两者之间含有5个单一酶切位点(XbaⅠ，BamHⅠ，SmaⅠ，KpnⅠ，SacⅠ)，此外还具有既在细菌中，也在植物中表达的抗卡那霉素的选择标记。以XbaⅠ与SacⅠ双酶切下pUⅠ上的卫星cDNA片断，其方向与ROKⅡ中的35s启动子方向一致，低熔点琼脂糖胶回收卫星cDNA片断。中间载体RoK-Ⅱ以同样的酶双酶切，并以低熔点琼脂糖胶回收质粒片断。卫星cDNA片断与RoKⅡ进行连接。连接产物转化Ca2+方法处理的E.coli感受态细胞，制备转化菌落质粒，以XbaⅠ与SacⅠ双酶切并电泳分析插入片断以确定阳性克隆(pRⅠ)。以BamHⅠ与SacⅠ双酶切含CP基因质粒中外壳蛋白基因片断，以低熔点琼脂糖胶回收，构建外壳蛋白基因片断到RoKⅡ中，其方法同上所述。制备转化菌落质粒并酶切分析以鉴定筛选插入有外壳蛋白基因片断的阳性克隆(pRCP).按图3所示将卫星cDNA与壳蛋白基因构建到同一ROKⅡ载体中。以BamHⅠ和SacⅠ双酶切RoRⅡ，以低熔点琼脂糖胶回收载体片断，以EcoRⅠ酶切上述含CP的质粒pRCP，用大片断酶补齐，以BamHⅠ酶切并回收有终止序列的外壳蛋白基因片断(CP-ter片断)。含有卫星RNA基因的质粒pRⅠ以HindⅢ酶切，以大片断酶补齐，然后以SacⅠ酶切，回收连有35S启动子片断的卫星cDNA片断(35S-Sat片断)。将CP-ter片断与35S-Sat片断连接到上述制备的RoKⅡ上，连接产物转化Ca2+方法处理的E.coli感受态细胞。制备转化菌落的质粒，鉴定插入有CP基因和卫星RNA基因的克隆(pRCPⅠ).所得到的植物转化载体(pRCPⅠ)含有两个表达盒，外壳蛋白基因与卫星cDNA分别插入到这两个表达盒中(图3)。 按本
的专业人员使用的常规方法进行三菌接合，将上述构建的含CP基因和卫星RNA基因的载体引入含Ti质粒的农杆菌中，将上述三菌接合的克隆转化植物叶片，转化的植物可以为双子叶植物的叶片，特别是茄科，十字花科和葫芦科的植物。用组织培养的方法从转化的叶片中再生出植株。在转基因植株中测定CP和卫星RWA的表达。转基因的当代植株中测定CP的表达，用Western杂交测定转基因产物中的外壳蛋白。从转基因植株叶中提取蛋白，电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，与CMV抗血清反应。用Northern杂交测定植株中CP基因的转录产物RNA，从转基因植物的叶片中提取总RNA，电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，与DNA探针杂交。放射自显影检测杂交结果。用电泳法和点杂交两种方法检测卫星RNA在转基因植物中的表达。转化植株和对照植株分别接种不含卫星RNA的CMV-B，提取核酸进行电泳、染色，进行点杂交。从上述方法检测结果表明在转基因植株中两种基因都得到表达。用本方法构建的转基因植物可同时表达外壳蛋白和卫星RNA，嵌合基因植株接种病毒后，病情指数明显下降。本专利技术提供了CMV-JV株外壳蛋白的基因，含有图2的序列。本专利技术提供一种含有图1的卫星RNA的基因和图2的蛋白外壳基因的转化载体，所说的外壳蛋白基因和卫星RNA基因各带有花叶菜花叶病毒35S启动子和蓝曙红合成酶转录中止子序列。一种含有上述的转化载体的细菌细胞。一种转化植物细胞，含有CMV-JV株外壳蛋白基因，CMV卫星RNA-1基因，所说的外壳蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用植物基因工程技术构建抗黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的转基因植物的方法，其特征在于将病毒外壳蛋白（ＣＰ）基因和卫星ＲＮＡ（ＳａｔＲＮＡ）基因同时引入植物染色体中，转基因产物能同时表达病毒外壳蛋白和卫星ＲＮＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶寅，田波，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]