一种隐孔菌菌粉的生产方法技术

本发明专利技术提供了一种隐孔菌菌粉的生产方法。隐孔菌菌丝在２３－３０℃、ｐＨ为４－７的培养基中培养６－７天；移入带培养液的烧瓶中振荡培养５天（频率１５０－２２０ｒｐｍ、温度２３－３０℃）；用压差法将菌丝液移入带培养液的种子罐中培养４８ｈ（通风量１∶０．２－１．０（ｖ／ｖ分钟），叶轮搅拌速度１００－２００ｒｐｍ，罐压０．５－１．０ｋｇ／ｃｍ↑［２］，温度２３－３０℃）；将种子罐培养的菌丝液装入带培养液的发酵罐发酵４天（通风量１∶０．２－０．６（ｖ／ｖ分钟），叶轮搅拌速度１００－２００ｒｐｍ，罐压０．５－１．０ｋｇ／ｃｍ↑［２］，温度２３－３０℃，经烘干、粉碎、过筛得到隐孔菌菌粉。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物的生产方法，特别是。隐孔菌Cryptoporus volvatus(peck)Hubbard属于非褶菌目，多孔菌科，隐孔菌属，只有单一的一个隐孔菌种。具有平喘、止咳、祛痰、抗过敏、抗感染等药用功效，是一种高效、低毒、无副作用的药物。其植物形态、生长环境、生物学特性、药用功效等已在国内外文献杂志中作过多次报道，如《药用真菌隐孔菌的生物学特性研究》(作者华启洪、孙静、沈礼，“中国中药杂志”1991年第16卷第12期)；《中药隐孔菌挥发油成分研究》(作者华启洪、金国梁、沈礼，“中国药学杂志”1993年第28卷第2期)；《中药隐孔菌的化学成分》作者华启洪、金国梁，“植物资源与环境”1993.2(1)60-61页)。《隐孔菌生产的抗肿瘤多糖》(Antitumor polysaccharigdesproduced by Cryptoporus)[作者Usno，Saburo等，japen，kekai7894，021，1978；C.A.Vol，89，195409h).《隐孔菌生长所需要的营养素》(Nutritional reguirents forgrowth of Cryptoporus volvatus)作者Peffey，ThomasM.Can.J.Bot.1989.67(8)，2532-4，1989；C.A.Voi.111.211745v。《云南本草》(作者兰茂，云南人民出版社出版，)见附件。野生隐孔菌在黑龙江、河北、湖北、福建、广东、广西、海南岛、四川、云南、西藏、陕西、吉林、浙江、江西等省均有分布，但比较分散，采集加工困难，而且药源数量稀少。隐孔菌菌种可由野生隐孔菌经组织分离、驯化培养获得，也可以直接向中国科学院昆明植物研究所购买(见附件证明)，因此隐孔菌已经多次在国内外期刊文献中使用，为本领域的专业人员所熟知，菌种也可以任意购得，可以认为隐孔菌菌种是公众能够得到的，所以该菌种的生产方法申请专利时，不需要提交中国专利局指定的单位保藏。我国支气管哮喘的患病率占总人口的5.29％左右，达四、五千万人之多，且尚有日益增多的趋势，目前临床上使用的药物有一定的副作用和毒性，尤其对心血管的副作用更大，虽然隐孔菌具有很好的平喘、止咳功效，且低毒无副作用，可以成为一种优良的平喘、止咳药物。但尚未有工业化规模生产隐孔菌药物的报导。本专利技术的目的就是要提供一种隐孔菌菌粉的规模化生产方法。本专利技术的任务是以如下方式完成的，其特点在于(a)将保存在4±1℃条件下的已知隐孔菌菌种Cryptoporusvolvatus(peck)Hubbard通过无菌操作移植到下述培养基中，在23—30℃条件下活化培养6-7天，培养基的组分和含量为葡萄糖 10-50g玉米粉 5-20g酵母粉 0.5-2gKH2PO40.5-2gMgSO40.2-1gVB13.0-5.0mg琼脂20g水 1000ml上述培养基的PH值为4—7，消毒灭菌，然后(b)将上述活化后的隐孔菌菌丝移入内装200-250ml下述培养基的1000ml三角烧瓶中，在振荡频率为150-220rmp、温度为23—30℃条件下在旋转式摇瓶机中振荡培养5天，培养基的组分及含量为葡萄糖 20-50g玉米粉 10-20g酵母粉 1-3gKH2PO40.1-1gMgSO40.05-0.5gVB13.0-5.0mg水 1000ml上述培养液的PH值为4-7，消毒灭菌，然后(c)在100l3的种子罐中装入等于或小于70％罐容量的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量5-10％摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.2-1.0(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为100-200rpm，罐压0.5-1.0kg/cm2，温度23-30℃条件下培养48h，培养液的组分及含量为葡萄糖 50-400g玉米浆 4-15g蛋白胨 1-8g酵母膏 1-3gKH2PO40.5-2gMgSO40.25-1.0g(NH4)2SO42-8g水 1000ml上述养液的PH值为4-7，消毒灭菌，然后(d)在1000l3-5000l3的发酵罐中装入等于或小于70％罐容量的下述培养液，再装入5-10％罐容量的种子罐培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.2-0.6(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为100-200rpm，罐压0.5-1.0kg/cm2，温度为23-30℃条件下培养发酵4天，培养液的组分及含量为葡萄糖 50-400g玉米浆 4-15g蛋白胨 1-8g酵母膏 1-3gKH2PO40.5-2gMgSO40.25-1.0g(NH4)2SO42-8g水 1000ml上述培养液的PH值为4-7，消毒灭菌，然后(e)将上述发酵罐内的隐孔菌菌丝液体压滤，所得隐孔菌菌丝体滤饼在70-100℃条件下烘干、粉碎、过筛得到颗粒小于60目的隐孔菌菌粉。本专利技术方法和已知技术相比，所采用的隐孔菌菌种易得，由于它通过三级通气发酵进行自我繁殖而被大量获得，其得率达到0.4-1.2％。本专利技术方法所采用的培养基，培养液中的碳源和氮源组分价格很便宜、含量也不高，因此生产成本很低。将用本专利技术方法生产的隐孔菌菌粉装入胶囊即可构成《平喘胶囊》药物，按年产隐孔菌菌粉4T计，可生产57万盒平喘胶囊(0.29g×24/盒＝6.96g/盒)，每盒成本约3元，出厂价为21元/盒，税后利润为14.94元/盒，总利润为850万元。按我国4-5千万病人中有1％，服平喘胶囊一个疗程(9粒×15天)计，每年预计销售量为240万盒，总年利润约3600万元，因此具有很好的经济效益。本专利技术方法无污染，因此也有很好的环境效益。用本专利技术方法生产的隐孔菌菌粉所作的药理试验如下试验单位(浙江医科大学杭州分校)1、镇咳试验实验方法小白鼠氨水引咳法 ※5％阿拉伯树胶1毫升/公斤。※※可待因50毫克/公斤实验结果表明，小白鼠服本专利技术方法生产的隐孔菌菌粉后，其在统计学上的P值小于0.05，表明镇咳效果显著，以大剂量试验的效果为最佳。2、祛痰作用实验方法采用小白鼠酚红法。 5％阿拉伯树胶1毫升/公斤。实验结果表明，用本专利技术方法生产的隐孔菌菌粉其祛痰效果很好，小、中、大剂量组在统计学上的P值均小于0.01，具有非常显著的效果。3、平喘作用实验方法采用药物性豚鼠哮喘模型，药物引喘法 实验表明，剂量在208毫克/公斤和2380毫克/公斤时，在统计学上的P值均小于0.01，表明本专利技术方法生产的隐孔菌菌粉的平喘效果非常显著。4、对豚鼠卵蛋白过敏性哮喘的拮抗作用实验方法采用豚鼠过敏性支气管痉挛试验法。 生理盐水※※含(生药)39.21毫克/毫升实验表明，本专利技术方法生产的隐孔菌菌粉对抗过敏的作用非常显著，其在统计学上的P值小于0.01。5、隐孔菌菌粉毒性生试验(1)急性毒性试验(LD50)口服(粉剂)LD50＞66克/公斤，最大耐授量39克/公斤～50.7克/公斤30.98毫克/公斤，22.77毫克/公斤(2)长期毒性试验(三个月)实验结果服药三个月后血液学检查和血清生化测定的各项指标都正常，病理切片观察，无异常发现，证明菌粉对心、肝、肾、脾、脑、睾丸或卵巢和造血系统等25个器官组织均无毒性反应。6、临床资料病例采自杭州市一院内科门诊成年及13岁以下支气本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于： （ａ）将保存在４±１℃条件下已知的隐孔菌菌种【Ｃｒｙｐｔｏｐｏｒｕｓ ｖｏｌｖａｔｕｓ （ｐｅｃｋ） Ｈｕｂｂａｒｄ】通过无菌操作移植到下述培养基中，在２３－３０℃条件下活化培养６－７天， 培养基的组分和含量为： 葡萄糖 １０－５０ｇ 玉米粉 ５－２０ｇ 酵母粉 ０．５－２ｇ ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］ ０．５－２ｇ ＭｇＳＯ↓［４］ ０．２－１ｇ ＶＢ↓［１］ ３．０－５．０ｍｇ 琼脂 ２０ｇ Ｈ↓［２］Ｏ １０００ｍｌ 上述培养基的ＰＨ值为４－７、消毒灭菌，然后， （ｂ）将上述活化后的隐孔菌菌丝移入内装２００－２５０ｍｌ下述培养液的１０００ｍｌ三角烧瓶中、在振荡频率为１５０－２２０ｒｍｐ、温度为２３～３０℃条件下在旋转式摇瓶机中振荡培养５天， 培养液的组分和含量为： 葡萄糖 ２０－５０ｇ 玉米粉 １０－２０ｇ 酵母粉 １－３ｇ ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］ ０．１－１ｇ ＭｇＳＯ↓［４］ ０．０５－０．５ｇ ＶＢ↓［１］ ３．０－５．０ｍｇ 水 １０００ｍｌ 上述培养液的ＰＨ值为４－７、消毒灭菌，然后 （ｃ）在１００ｌ↑［３］的种子罐中装入等于或小于７０％罐容量的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量５－１０％摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为１∶０．２－１．０（ｖ／ｖ分钟）、叶轮搅拌速度为１００－２００ｒｐｍ、罐压０．５－１．０ｋｇ／ｃｍ↑［２］，温度２３－３０℃条件下增养４８ｈ， 培养液的组分及含量为： 葡萄糖 ５０－４００ｇ 玉米粉 ４－１５ｇ 蛋白胨 １－８ｇ 酵母膏 １－３ｇ ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］ ０．５－２ｇ ＭｇＳＯ↓［４］ ０．２５－１ｇ （ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］ ２－８ｇ 水 １０００ｍｌ 上述培养液的ＰＨ值为４－７，消毒灭菌，然后 （ｄ）在１０００－５０００ｌ↑［３］的发酵罐中装入等于或小于７０％罐容量的下述培养液，再装入５－１０％罐容量的种子罐培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为１：０．２－０．６（ｖ／ｖ分钟），叶轮搅拌速度为１００－２００ｒｐｍ，罐压０．５－１．０ｋｇ／ｃｍ↑［２］，温度为２３－３０℃条件下培养发酵４天， 培养液的组分及含量为： 葡萄糖 ５０－４００ｇ 玉米浆 ４－１５ｇ 蛋白胨 １－８ｇ 酵母膏 １－３ｇ ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］ ０．５－２ｇ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：华启洪，金国梁，孙静，
申请(专利权)人：华启洪，金国梁，孙静，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]