含硒抗体酶的制备方法技术

本发明专利技术属于高活力含硒抗体酶的制备方法。本发明专利技术提出一种新的抗体酶设计理论，设计系列结构合理的半抗原，通过单克隆抗体制备技术得到由底物结合部位和催化部位共同组成活性中心疏水腔的单抗，然后用ＮａＨＳｅ代替硒化氢将催化基团定量引入到疏水腔中，从而得到活力高于天然含硒谷胱甘肽过氧化物酶的抗体酶。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于高活力含硒抗体酶的制备方法。含硒谷胱甘肽过氧化物酶(简称GPX)的催化基团为硒代半胱氨酸(Sec)，它以还原型谷胱甘肽(GSH)为底物，可将过氧化氢(H2O2)或脂氢过氧化物(ROOH)还原成水或醇(ROH)，体内缺乏该酶时会引起心脑血管疾病、癌症、克山病、老年性疾病(如白内障)等。目前人们都是用含硒小分子化合物模拟该酶的生物功能，如Ebselen，Glutaselenone等，但催化效率仅为天然GPX的千分之一左右。八十年代后期才出现的抗体酶研究领域为GPX的人工模拟开辟了一条新途径。目前抗体酶所能催化的反应有近百种，但催化效率要比天然酶普遍低2～3个数量级。中国专利94102481.4公开了题为“化学突变具有底物结合部位的单克隆抗体制备含硒抗体酶的方法”，该方法的制备过程为GSH与2，4-二硝基氯苯(DNCB)反应，制得S-二硝基苯取代的谷胱甘肽(GSH-S-DNP)作为半抗原；用戊二醛将半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联在一起作为全抗原；将全抗原加入福氏佐剂免疫小鼠，用标准单抗制备方法得到对GSH-S-DNP具有特异结合能力的单克隆抗体被命名为4A4。用苯甲基磺酰氟(PMSF)活化单抗可变区丝氨酸残基(Ser)上的羟基，再用硒化氢(H2Se)处理，则将Ser变成Sec，从而得到具有GPX活力的含硒抗体酶Sec-4A4(为了与没引入催化基团的单抗相区别，将含有Sec的抗体酶名前加Sec)，活力为1239酶活单位/微摩尔(U/μmol)，是天然兔肝GPX(5780U/μmol)的0.21倍，与天然酶相比催化效率还有一定差距，因此如何提高抗体酶活力、使其接近甚至超过天然酶并具有应用价值是抗体酶研究的关键所在。含硒抗体酶Sec-4A4活力不高主要有两个原因首先是半抗原结构设计的不合理，所用的半抗原为GSH-S-DNP，只是将GSH中较活泼的巯基用2，4-二硝基苯基团(DNP)进行了保护，从而提高了半抗原的稳定性和免疫原性。而用该半抗原免疫得到的单克隆抗体4A4对底物GSH的束缚作用过强，不利于底物向产物的转化；且抗原结合部位的空间相对较窄，不利于脂氢过氧化物进入活性中心，引起催化部位的有效空间窄小，使得催化基团不能充分发挥催化作用。另外天然酶的活性中心是一个位于分子表面扁平低凹处的疏水腔，而该半抗原带有两个负电荷的羧基，因此该半抗原的设计具有一定的片面性。在含硒抗体酶Sec4A4的制备中另一个需要创新的地方就是催化基团的引入。天然GPX中每个活性中心上只有一个Sec，而该专利技术中引入GPX催化基团Sec的主要步骤为先用PMSF活化单抗4A4可变区中Ser上的羟基，再通入过量的H2Se气体，使得Ser变成Sec。其中PMSF和H2Se都是大过量的，特别是H2Se不能够定量加入，使得反应体系中有单质硒析出，吸附在抗体分子表面上，很难除去，同时还引起Sec-4A4中Sec的引入过多、过乱，用5，5-二硫基双-2-硝基苯甲酸法测得每分子Sec-4A4上有五个Sec，而一个抗体分子上只有两个活性中心，说明Sec-4A4上不仅活性中心有Sec，而且非活性中心也含有Sec，这些非活性中心的Sec不仅催化效率极低，而且有可能影响活性中心的Sec发挥催化功能，对研究活性中心的催化机理还具有干扰作用，因此引入催化基团的方法还应进一步的改进，这对提高抗体酶的活力也是非常重要的一步。本专利技术的目的在于提出一种新的抗体酶设计理论，设计系列结构合理的半抗原，通过单克隆抗体制备技术得到由底物结合部位和催化部位共同组成疏水腔的单抗，然后用NaHSe代替H2Se将催化基团定量引入到疏水腔中，从而得到活力高于天然酶的抗体酶。本专利技术是在天然酶结构信息的基础上，以底物为蓝本，用系列疏水性修饰剂修饰底物，屏蔽底物带电基团，包括羧基、氨基、巯基等，增强半抗原的疏水性，从而诱导出在抗原结合部位上具有由底物结合部位和催化部位共同组成疏水腔的单抗，降低抗体对底物过强的亲和力，使得单抗对底物的亲和力与天然酶对底物的亲和力相当，再通过化学修饰方法将催化基团Sec引入，即用PMSF活化单抗可变区中丝氨酸上的羟基，选用液体NaHSe作为亲和试剂与活化的羟基反应，使得每个抗体分子上疏水腔内定量引入一个Sec，其它非活性部位不含有Sec，并且单质硒不易析出。本专利技术合成步骤I.半抗原的设计与合成选择一组制备具有GPX活性含硒抗体酶的系列半抗原，结构如下 其中R为碳个数1～4的疏水性基团，包括甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基。合成分两步首先GSH的巯基与2，4-二硝基氯苯(DNCB)在0℃反应，合成出含硒抗体酶Sec-4A4的半抗原GSH-S-DNP，然后再与1-4碳相应的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇等反应，将0.5～3.0ml 1-4碳的醇冷却至0～-10℃，分批加入0.1～0.3ml SOCl2，加入0.2～0.4克GSH-S-DNP室温放置2～4小时，补加3～10ml醇溶液，70～130℃回流30～60分钟，反应液在4～-30℃冷却，有固体析出，再用相应醇溶液重结晶，即得到疏水性较强的纯品半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯。II.全抗原的合成6～12mg BSA与4～10mg半抗原溶于磷酸钠缓冲液中(pH7.2，0.2mol/L)，慢慢滴入0.3～1.0ml戊二醛溶液，反应10～15小时，加入6～15mg甘氨酸终止反应，用pH7.5，0.05mol/L磷酸钠平衡的交联葡聚糖凝胶(Sephadex G-25)层析柱分离，收集第一峰为全抗原。III.单克隆抗体的制备将全抗原1.0～3.0mg/ml与福氏完全佐剂以体积比1∶1混合，每只BALB雌鼠注射0.2ml，两周后进行第二次免疫，四周后换成福氏不完全佐剂，第六周不加佐剂免疫，融合前三天不加佐剂加强免疫；鼠脾细胞与骨髓瘤细胞10∶1比例混合，在聚乙二醇/二甲亚砜作用下融合一分钟，播种在已加入巨噬细胞的培养板上，用含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷培养基(HAT培养基)在37℃二氧化碳培养箱中培养，用酶联免疫标记方法(ELISA)检测，两次呈阳性的细胞株进行克隆，将腹水经过预处理、45％硫酸铵沉淀、二乙基氨基乙基-纤维素(DEAE-52)离子交换柱层析(5mmol/L，pH 7.5Tris-HCl含20mmol/L NaCl缓冲液平衡，100mmol/L NaCl缓冲液洗脱)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P-200)过滤(0.2mol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl)、蛋白G(HiTrapproteinG)亲和层析(pH 7.0 20mmol/L磷酸钠平衡，0.1mol/L pH 2.7甘氨酸-HCl缓冲液)将单抗纯化，经电泳检验为一条带，分子量为15万道尔顿。IV.催化基团的引入0.5～1.0×10-8mol/L单抗溶在pH 7.0磷酸钠缓冲液中，加入3.0～6.1×10-8mol/L PMSF，室温振荡1～1.5小时，在高纯氮保护下加入1.0～2.1×10-7mol/L NaHSe溶液，35～40℃保温36～40小时，将反应液经过Sephadex G-25除盐后，冻干即得在单抗可变区上既有GSH结合部位、又有Sec的催化部位、活力达到天然GPX的含硒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活力高于天然含硒谷胱甘肽过氧化物酶（简称ＧＰＸ）的含硒抗体酶的制备方法，其特征在于选择一组ＧＰＸ底物谷胱甘肽的衍生物作为制备含硒抗体酶的系列半抗原，结构入下：＊＊＊其中Ｒ为碳个数１～４的疏水性基团，包括甲基、乙基、丙基、正丁基、 异丁基；合成分两步：１）．首先ＧＳＨ的巯基与２，４－二硝基氯苯（ＤＮＣＢ）在０℃反应，合成出含硒抗体酶Ｓｅｃ－４Ａ４的半抗原ＧＳＨ－Ｓ－ＤＮＰ，然后再与１－４碳相应的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇等反应，将０．５～３．０ｍｌ１－ ４碳的醇冷却至０～－１０℃，分批加入０．１～０．３ｍｌＳＯＣｌ↓［２］，加入０．２～０．４克ＧＳＨ－Ｓ－ＤＮＰ室温放置２～４小时，补加３～１０ｍｌ醇溶液，７０～１３０℃回流３０～６０分钟，反应液在４～－３０℃冷却，有固体析出，再用相应醇溶液重结晶，即得到疏水性较强的纯品半抗原Ｓ－二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯；２）．全抗原的合成６～１２ｍｇＢＳＡ与４～１０ｍｇ半抗原溶于磷酸钠缓冲液中（ｐＨ７．２，０．２ｍｏｌ／Ｌ），慢慢滴入０．３～１．０ｍｌ戊二醛溶液，反应１０～１５小时 ，加入６～１５ｍｇ甘氨酸终止反应，用ｐＨ７．５，０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸钠平衡的交联葡聚糖凝胶（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）层析柱分离，收集第一峰为全抗原；３）．单克隆抗体的制备将全抗原１．０～３．０ｍｇ／ｍｌ与福氏完全佐剂以体积比１ ∶１混合，每只ＢＡＬＢ雌鼠注射０．２ｍｌ，两周后进行第二次免疫，四周后换成福氏不完全佐剂，第六周不加佐剂免疫，融合前三天不加佐剂加强免疫；鼠脾细胞与骨髓瘤细胞１０∶１比例混合，在聚乙二醇／二甲亚砜作用下融合一分钟，播种在已加入巨噬细胞的培养板上，用含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷培养基（ＨＡＴ培养基）在３７℃二氧化碳培养箱中培养，用酶联免疫标记方法（ＥＬＩＳＡ）检测，两次呈阳性的细胞株进行克隆，将腹水经过预处理、４５％硫酸铵沉淀、二乙基氨基乙基－纤维素（ＤＥＡＥ－５２）离子交换柱层析（５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．５ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ含２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ缓冲液平衡，１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ缓冲液洗脱）、聚丙烯酰胺凝胶（Ｂｉｏ－ｇｅｌ Ｐ－２００）过滤（０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）、蛋白Ｇ（ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎＧ）亲和层析（ｐＨ７．０ ２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠平衡，０．１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ２．７甘...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁兰，赵大庆，倪嘉缵，罗贵民，刘仔，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：22[中国|吉林]