大豆花粉管通道转基因及其品种改良技术制造技术

一种大豆花粉管通道转基因方法，包括外源基因的提纯，选择受体大豆并种植至开花；选择当日开的花，在授粉后合适的生理时间，用眼科小剪从雌蕊靠近子房处剪去柱头；在切口处滴１５～２０ｕ１ＤＮＡ导入液，在幼胚至种子成熟时，取幼胚进行组织培养水平筛选或者对种子及幼苗处理和田间筛选，得到转基因大豆进而进行品种培育。本发明专利技术导入外源ＤＮＡ分子，扩大基因资源的利用率和范围，创造种质，培育品系；有周期短，转化率高等特点。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于在大豆上转移外源基因以及大豆种质改良技术。将外源DNA(基因)转至受体农作物，使农作物产生新的、人们期望的性状的技术，被称之为转基因技术。它不同于常规的有性杂交，使双亲的遗传组成在染色体水平进行交换重组，而是在分子水平即在载有遗传信息的DNA分子水平进行重组和交换、使基因发生改变。迄今为止，国际上现有的转移外源基因的方法按技术的属性分有三类①物理法，如基因枪、电激、显微注射、激光、超声波、碳化硅纤维；②化学法，如磷酸钙-DNA共沉淀、聚乙二醇(PEG)、脂质体等；③生物学法，如农杆菌介导Ti质粒转移、花粉携带、花粉管通道。综合分析国际文献，农杆菌法及基因枪法目前在应用上占主导地位，其它方法也有利用。评价一个转基因技术好与否，要考虑其是否高效，是否易于重复，难易程度及其适用范围。一个成熟的、实用性广泛的转基因技术系统，必须具备高效、重复性高、简易、快速、适用性广等特点。其中最重要的是转化频率要高，易于重复，以及没有基因型依赖性。基因型的依赖性以及某些重要农作物的转化效率低被公认为是目前植物基因工程发展的主要限制因素。下面对几个主要方法作一分析(一)农杆菌介导法农杆菌介导转化，是借助于农杆菌细胞内自有的Ti质粒可以向植物细胞内转移并可插进植物细胞基因组内复制增殖的特性，人为地将重组DNA装至Ti质粒上，再让农杆菌侵染植物，把人们所需要的基因通过Ti质粒转入植物细胞。这个技术一般需要建立植物组织培养再生系统，农杆菌侵染经培养的外植体，然后在选择压力下，筛选出转化愈伤组织，再经再生获得转基因(DNA)植株。其优点相对简单易于操作，对大多数双子叶植物的各种器官或组织均适合，但存在基因型依赖性，特别是对一些不易于再生的作物，转化效率很低，大豆属于此类。(二)基因枪转化法基因枪技术的基本原理是以火药爆炸、高压放电或高压气作驱动力，将载有外源DNA的钨、金等金属颗粒加速，射击真空室中的靶细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入靶细胞中的目的。其步骤包括微粒子弹装备、装枪、轰击、过渡培养和选择培养。此技术可用于双子叶和单子叶植物，受体靶可以是组织也可以是细胞，与农杆菌法相比，克服了一些基因型对农杆菌不敏感的缺欠，特别是可用于单子叶植物，因而是继农杆菌介导法之后又一广泛应用的遗传转化技术。其不足之处转化效率比农杆菌还低；基因枪的造价高，转化成本也高，而且也必须有一个组织培养再生系统。(三)PEG介导转化、电击穿孔转化、显微注射、激光微束、超声波、脂质体介导等这些方法的前提都建立在有成功的植物细胞和原生质体培养系统基础上，由于原生质体培养相对于组织培养更困难，因此应用受到限制。(四)花粉管通道法花粉管通道法的原理是植物在开花授粉受精过程中，在从柱头到胚囊之间形成可使大分子通过的通道，而胚囊此时又呈部分无壁的原生质体状态，外源DNA分子可进入细胞参与受体基因组DNA的合成复制。本方法可在室外操作，在植株开花的某一时刻，将DNA分子溶液在合适的受精生理时期，采取合适的方法注入胚囊，实现转化目的。此技术不需要组织培养以及转化仪器设备，操作简便，易于掌握，而且可克服基因型的限制。此技术需针对不同作物采用不同方法细则操作。棉花是此技术首先成功的对象。本专利技术的目的是建立一个适用于大豆的转DNA(基因)技术，并用此技术向大豆转移各种来源的DNA分子，以达到改变大豆遗传DNA分子组成，创造大豆新种质，改良大豆品种。本专利技术的目的是这样实现的一种大豆花粉管通道转基因方法，包括外源基因的提取纯化，选择受体大豆并种植至开花，对花器官进行处理，注入DNA导入液，对种子及后代进行鉴定筛选；选择受体大豆当日开的花，去除翼瓣、龙骨瓣，留中央旗瓣，露出柱头，用眼科小剪从雌蕊靠近子房处剪去柱头；在切口处滴15～20ulDNA导入液，在幼胚至种子成熟时，或取幼胚进行组织培养筛选或取成熟种子对其进行种子处理筛选，得到转基因大豆。DNA导入液以0.1×SSC、TE、或ddH2O溶解外源DNA，浓度为25-150ug/ml质粒DNA，100-500ug供体基因组总DNA。外源基因为大豆或者非大豆基因，来源可为种间，属间，科间以至微生物。外源基因为各种抗性、品质及其它有益性状基因。受体为大豆品种、品系或者中间材料。受体大豆当日开花的生理时间为其自花受粉后6-14小时。幼胚组织培养筛选是将选择剂配制到培养基中，将转基因幼胚用该培养基培养，从培养的幼胚愈伤组织再生苗中选择抗选择剂植株。种子处理筛选为将收获的转基因大豆种子无菌接在具有选择剂的培养基上使其萌发根系发育正常者为抗性阳性苗；用选择剂浸泡后，播于营养钵、珍珠岩或者河沙内，根系正常生长株为抗选择剂单株，将抗选择剂单株转于田间或者大盆栽培继续做分子生物学鉴定和农艺性状鉴定。选择剂根据载体上所具有的选择标记基因而定，如Bar基因选用Basta除草剂，Npt II基因选用卡那霉素；Basta、卡那霉素，选择浓度为50-1000PPM，处理时间组织培养为培养期间，种子浸泡为6-12小时。种子处理筛选为将收获的转基因大豆种子，播于盘中或者田间，在幼苗期，取叶片提取DNA做PCR分析，阳性者用于继续鉴定和培养。对改良目标品种导入含目标性状的共体DNA，从导入后代中选择目标变异或转化株，通过农艺性状鉴定筛选，株系品系培育，获得含目标性状的优良种质、品系或品种，实现种质创新和改良。下面详细叙述本专利技术的内容本专利技术可分为两部份一是外源DNA(基因)转化的花粉管通道技术；二是应用于大豆种质创新与品种改良的方法与结果。第一部分包括几个步骤①外源DNA的提取纯化；②受体大豆的种植，培育至开花；③转化操作；④培育大豆至结实，并收获；⑤于田间或实验室种植种子，进行筛选和分子检测。分解描述如下1.外源DNA(基因)的提取与纯化此步操作方法参照发表过的书刊杂志介绍的方法进行。外源DNA供体包括任何来源的动植物以及微生物，包括提取总DNA和通过从细菌克隆的重组DNA。2.受体大豆材料的种植，在适合其正常生长开花的环境下种植，培育至开花。受体大豆可是以任何品种和品系。3.实施导入。其细则如下①选择当日开的花，生理时间为其自花受粉后6～14小时，(每节选2-3朵其余去除)；②去除翼瓣、龙骨瓣，留中央旗瓣，露出柱头，用眼科小剪从雌蕊靠近子房处剪去柱头；③在切口处滴15～20ulDNA导入液。导入液可用0.1×SSC、TE、或ddH2O配制，浓度为25-150ug/ml(质粒DNA)、50～300ug/ml(供体总DNA)。4.在胚成熟至种子成熟的任何时期取下籽粒进行如下任何方式的鉴定筛选1)取下幼胚，进行幼胚组织培养，培养期间进行抗生素等选择标记筛选；2)待种子成熟后，取出籽粒，用选择剂处理筛选，可以有几种方法a.用高浓度选择剂浸泡种子，然后将种子播于营养钵内，正常生长者移栽于田间或大盆中栽培；浓度范围需根据基因载体中筛选标记种类及受体材料的不同事先做临界浓度的确定试验，如对NPT II基因卡那霉素的浓度可在500-1000PPM，处理时间可在6-12小时。b.用高浓度(浓度选择及处理方法与上述a相同)选择剂浸泡种子，然后播于珍珠岩或河沙中萌发后观查根系发育情况，正常者为初选转化株；c.用低浓度(卡那霉素的浓度可在50-20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大豆花粉管通道转基因方法，包括外源基因的提取纯化，选择受体大豆并种植至开花，对花器官进行处理，注入ＤＮＡ导入液，对种子及后代进行鉴定筛选；其特征在于：选择受体大豆当日开的花，去除翼瓣、龙骨瓣，留中央旗瓣，露出柱头，用眼科小剪从雌蕊靠近子房处剪去柱头；在切口处滴１５～２０ｕｌＤＮＡ导入液，在幼胚至种子成熟时，或取幼胚进行组织培养筛选或取成熟种子对其进行种子处理筛选，得到转基因大豆。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘德璞，袁鹰，周正平，王成武，郑培和，王丙旭，王兴智，唐克轩，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：22[中国|吉林]